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四環素誘導目的基因沉默模型

簡介

小發卡或短發卡RNA（a small hairpin RNA or short hairpin RNA, shRNA）是指一段具有緊密發卡環的RNA序列，常被用于RNA干擾、沉默靶基因的表達。將shRNA表達元件引入多順反子熒光報告基因元件，與創新性四環素誘導表達系統和ES細胞打靶技術結合，能夠在特定的組織、細胞及其不同發育階段實現對內源基因的特異性沉默，提供給研究者一個精確且多功能的工具來研究基因沉默。

技術原理

吉瑪新開發的以miR30和shRNA為基礎的目的基因沉默模型：

1. shRNA表達元件作為目的基因的一部分被構建在多基因組合的表達框中，通過調控shRNA表達來達到基因沉默的目的：shRNA表達后被內源性miRNA加工處理，形成功能性的shRNA分子，這些成熟的shRNA有效地靶向、降解感興趣的內源基因。

2. 利用四環素響應啟動子元件來調控shRNA表達：添加Dox， shRNA表達；停止Dox供應，shRNA不表達。

3. 熒光蛋白（tdTomato）基因同時被構建在shRNA相關表達框中，跟隨shRNA特異性表達，更直觀地展示陽性結果。

4. 通過ES細胞打靶技術獲得F0代嵌合鼠，進一步繁育后獲得含遺傳信息的后代小鼠。

與常用的慢病毒表達系統相比，四環素誘導基因沉默模型具有以下優勢：

• 轉基因的整合位點是可預測和可控的，操縱更精確；
• 通過與不同的Cre品系雜交，可以實現shRNA組織特異性表達；
• Dox在任何發育階段添加均可誘導基因沉默，增強了模型的靈活性；
• 轉基因表達是可逆的，不再添加DOX，基因沉默可以被關閉。

總的來說，獨特的可誘導性和可逆性的沉默系統可在人為控制下，實現小鼠特定組織中特異性、可逆的內源基因沉默。

上皮細胞轉化序列2（Ect2）是一種鳥嘌呤核苷酸交換因子（GEF），可催化GDP與GTP的交換，在細胞極性、紡錘體組裝、細胞分裂等多種信號通路中充當分子開關。

結果：表達Ect2 shRNA導致小鼠ES細胞中的多倍體出現，并延遲小鼠胚胎的發育。