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點突變（point mutation）

簡介

點突變是指單個堿基對發生改變的基因突變，利用點突變技術可將人類致病突變位點引入小鼠相對應的原位位點。點突變對基因功能與表型有深遠影響，并在各類疾病中起到重要作用。

技術原理

CRISPR或TALEN介導的點突變是指目標位點被切割，DNA雙鏈斷裂，在與目標編輯位點高度同源的單鏈寡核苷酸 (single-stranded oligonucleotide，ssODN) 存在的情況下，細胞使用單鏈寡核苷酸作為模板，利用同源重組修復（homology-directed repair，HDR）機制介導單鏈寡核苷酸的插入。

通過這種機制可以實現的點突變包括：

• 單堿基或多堿基突變
• 插入小DNA片段，例如loxP位點、Tag或其他小DNA片段
• ssODN介導的基因組片段（1bp-數kb）精準刪除

ssODN介導的基因組片段精準刪除示意圖

利用 ssODN介導的精準刪除：

• 可按研究者的要求精準刪除目標蛋白的一個或多個結構域序列，同時保持蛋白表達基本元件、剩余序列不變。
• 精準刪除的片段可大可小，單一外顯子內片段刪除或不同外顯子之間片段刪除均可。
• 重要的是，這種方法不同于常規的異位表達( ectopic expression)，不會影響目標基因啟動子和其余未刪除序列的轉錄。

脊髓型肌萎縮癥（SMA）是一種嚴重的遺傳性神經肌肉疾病，SMA患者攜帶了不同的SMN1突變，不能產生足夠的SMN蛋白而致病。他們都有SMN2基因，由SMN2基因產生的SMN蛋白或可以彌補由SMN1基因突變引起的蛋白質缺乏。但SMN2基因的外顯子7的第6位核苷酸出現C>T點突變，使得轉錄后的SMN2缺失第7個外顯子，導致表達的SMN蛋白被截短并迅速降解。

構建小鼠Smn1點突變（C>T）模型可以為SMA藥物探索提供有利的工具。

測序比對結果表明：純合小鼠Smn1 基因的7號外顯子第六個堿基點突變（C>T）成功。

Rest/Nrsf是一種重要的鋅指蛋白轉錄負調控因子，在神經細胞中，泛素依賴的蛋白酶復合體介導Rest/Nrsf翻譯后的降解，其中涉及到一種磷酸化依賴的E3連接酶-SCFβ-TRCP。目前，研究確定了Rest/Nrsf上的兩個可能的磷酸化區域，每個區域包含兩個或三個磷酸化殘基。

為了使泛素依賴的降解途徑失效，利用TALEN介導的多堿基突變技術，同時完成以下兩項突變：

1. 在小鼠基因組中突變了五個可能的磷酸化位點；
2. 在突變區域附近引入一個同義突變，形成BamHI酶切位點，方便后續基因型鑒定。

Rest/Nrsf 由三個主要結構域組成：N端抑制結構域、DNA結合結構域和C端抑制結構域。

為了研究單個結構域的功能，我們精準刪除了N端抑制結構域（92個氨基酸），從而產生了僅表達完整 DNA 結合結構域和完整C端抑制結構域的 Rest/Nrsf 的突變小鼠模型，為探索動物中N端和C端抑制結構域的不同生理功能提供了寶貴的工具。