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基因敲除（KO）

全身性基因敲除或完全基因敲除，就是業內常說的KO（Knockout），是指在小鼠所有組織細胞中，將目的基因的某些指定外顯子或功能結構域、甚至該基因所有外顯子敲除掉，導致目的基因的表達缺失。

技術原理：

CRISPR/Cas系統是原核生物體內的一種適應性免疫防御系統，抵御外界環境中的噬菌體和外源DNA的侵襲。CRISPR/Cas9介導的基因敲除是指在sgRNA通過與Cas9蛋白相結合，形成核糖體蛋白復合物，指引Cas9蛋白特異性切割目標基因，造成DNA雙鏈斷裂（DNA double-strand break，DSB）。在不同類型的基因組損傷中，DNA雙鏈斷裂是一種常見且高度有害的損傷形式，非同源末端連接修復（non-homologous end-joining, NHEJ）是細胞內DSB迅速、高效的修復方式之一，無需引入模板，直接將兩個DNA末端拼接，可能引起一些堿基缺失或插入基缺失或插入（indel  mutation），也可能導致基因組大片段敲除。當indel發生在編碼區或剪接位點處，可能會導致蛋白質結構和功能的改變，從而影響生物體的性狀，如編碼區的indel會引起移碼突變，即插入或缺失的堿基串的長度為3的非整數倍，可能導致整個閱讀框的改變。

基因敲除（KO）包括：

• 移碼突變-單gRNA位點
• 基因片段敲除（最大可敲除20 kb）-雙gRNA位點

案例1、移碼突變-Gene A

PCR-瓊脂糖凝膠電泳圖：                                                                        

Sanger測序結果：

結果：凝膠電泳圖譜無法判斷陽性結果，通過進一步測序比對可得到4個移碼突變的KO結果。

案例2、基因組片段敲除-Gene B

PCR-瓊脂糖凝膠電泳圖（部分結果）：

部分陽性樣本測序后比對結果：

結果：通過凝膠電泳圖可知：部分樣品被成功敲除目標片段，測序比對進一步證明：目標片段敲除成功。