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產(chǎn)品描述

吉瑪為了回饋廣大客戶(hù)對(duì)本公司的鼎力支持,特推出RNAi系列優(yōu)惠套餐，供廣大新老客戶(hù)選擇。

有效性承諾

客戶(hù)只需提供基因序列GeneID或者Accession number, 我們免費(fèi)幫您設(shè)計(jì)選擇合適的位點(diǎn)，siRNA oligo 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率達(dá)到70%以上，我們可以保證至少有一對(duì)可以有效的抑制相應(yīng)基因（mRNA)的表達(dá)，抑制效率可達(dá)70％(下限偏差不超過(guò)5%）.

功能介紹與實(shí)驗(yàn)實(shí)例

siRNA Real-Time PCR結(jié)果分析

對(duì)于RNAi實(shí)驗(yàn)而言，我們通常需要知道的是某一特定細(xì)胞在導(dǎo)入siRNA前后某一特定基因的表達(dá)變化情況來(lái)判斷siRNA起到了Gene Knockdown作用。應(yīng)用熒光定量PCR的方法，可以通過(guò)兩種途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)上述判斷，一是測(cè)定特定細(xì)胞在導(dǎo)入siRNA前后某一特定基因mRNA數(shù)量的變化，即為絕對(duì)定量；二是通過(guò)檢測(cè)特定基因與某一管家基因在在導(dǎo)入siRNA前后相對(duì)表達(dá)情況的變化，即為相對(duì)定量。通常采用相對(duì)定量的方法來(lái)檢測(cè)siRNA的Gene Knockdown作用。

1．Real-Time PCR 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

Real-Time PCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)包括實(shí)驗(yàn)組（導(dǎo)入siRNA），陰性對(duì)照（Negative Control）和Mock Transfection三組。每組至少三個(gè)重復(fù)。各組同時(shí)檢測(cè)目標(biāo)基因和管家基因的Ct值。下例中以GAPDH為管家基因。

使用方法

A．siRNA轉(zhuǎn)染的方法

哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)染的常見(jiàn)方法有：磷酸鈣共沉淀、電穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene、機(jī)械法（例如,顯微注射和基因槍?zhuān)?、?yáng)離子脂質(zhì)體試劑，其中陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑轉(zhuǎn)染法是目前最常用的轉(zhuǎn)染方法。

應(yīng)用脂質(zhì)體型轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染需要注重的幾個(gè)方面：轉(zhuǎn)染試劑的用量、siRNA的用量、轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度、轉(zhuǎn)染時(shí)的操作順序、細(xì)胞與轉(zhuǎn)染試劑/siRNA復(fù)合物的溫浴的時(shí)間


B．Lipofectamin2000 轉(zhuǎn)染試劑

選擇最適合的轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染條件，往往取決于不同的哺乳動(dòng)物細(xì)胞類(lèi)型和不同的核酸分子。Lipofectamin2000適用于核酸的體內(nèi)和體外操作，可應(yīng)用于DNA、RNA、反義寡核苷酸、siRNA的轉(zhuǎn)染，也可應(yīng)

用于DNA/siRNA的共轉(zhuǎn)染操作；是一種新型的高效siRNA轉(zhuǎn)染試劑。


Lipofectamin2000的應(yīng)用領(lǐng)域：

1、原代培養(yǎng)細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞株的基因轉(zhuǎn)染
2、siRNA高通量轉(zhuǎn)染試驗(yàn)
3、DNA轉(zhuǎn)染；DNA和siRNA的共轉(zhuǎn)染
4、核酸（siRNA、DNA、RNA）的體內(nèi)導(dǎo)入試驗(yàn)
5、貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染


Lipofectamin2000 的特點(diǎn)： 

1、不必更換培養(yǎng)基，操作簡(jiǎn)便易行，可在半小時(shí)內(nèi)完成操作
2、在含血清培養(yǎng)基中也能表現(xiàn)高轉(zhuǎn)染效率
3、細(xì)胞毒性低；適用細(xì)胞廣泛
4、即用型試劑，可在含有抗生素的完全培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染
5、基于脂質(zhì)的轉(zhuǎn)染試劑，確保沒(méi)有RNAse活性
6、可介導(dǎo)siRNA高轉(zhuǎn)染細(xì)胞及體內(nèi)siRNA的高效導(dǎo)入


C. Lipofectamin2000適用的細(xì)胞類(lèi)型

Lipofectamin2000轉(zhuǎn)染試劑可廣泛應(yīng)用于多種細(xì)胞系的DNA和siRNA轉(zhuǎn)染如：HeLa(人頸部癌細(xì)胞)、MCF-7(人乳房癌細(xì)胞)、Hep3B(人肝細(xì)胞癌細(xì)胞)、COS-7(猴腎細(xì)胞)、Neuro-2a(鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞)、NIKS(人角質(zhì)化細(xì)胞)、B16(鼠黑素瘤細(xì)胞)、DLD-1(人結(jié)腸癌細(xì)胞)、NIH/3T3(鼠胚胎成纖維細(xì)胞)、HT-29(人結(jié)腸腺癌細(xì)胞)、A549(人肺癌細(xì)胞)、CHO-k1(倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞)和293(腺病毒5 DNA轉(zhuǎn)化的人胚胎腎細(xì)胞),SVRbag4細(xì)胞等。


D．轉(zhuǎn)染前細(xì)胞培養(yǎng)

在細(xì)胞板上培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，應(yīng)使細(xì)胞匯合在24小時(shí)內(nèi)達(dá)到70-90%。


E．合適的lipofectamin2000用量

合適的siRNA(DNA)：lipofetamin2000比例對(duì)核酸的高效轉(zhuǎn)染有重要影響；我們推薦的DNA：lipofetamin2000為1：0.5—1：5（ug:ul），siRNA：lipofectamin2000為1：0.01-1：0.1（pmol：ul）一般情況下，此范圍內(nèi)都可獲得高的轉(zhuǎn)染效率。



F．貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染程序

選用生理狀態(tài)良好的細(xì)胞對(duì)提高轉(zhuǎn)染效率很重要。siRNA(DNA)和lipofectamin的用量和兩者的比例可在推薦范圍內(nèi)適當(dāng)調(diào)整。

1、轉(zhuǎn)染前一天，4-5′104細(xì)胞接種在24孔板上， 0.5mL含F(xiàn)BS和抗生素的DMEM（或Opti-MEM，其他培養(yǎng)基）細(xì)胞培養(yǎng)基。
2、選擇用于初期接種的細(xì)胞數(shù)量，應(yīng)能在24小時(shí)內(nèi)使細(xì)胞匯合達(dá)到70-90%。
3、在50μl的DMEM（或Opti-MEM，或其他無(wú)血清培養(yǎng)基）無(wú)血清培養(yǎng)基加入20pmol siRNA(或0.8μg DNA)，柔和混勻；
4、混勻lipofectamin試劑，用50μl無(wú)血清的DMEM或Opti-MEM，或其他無(wú)血清培養(yǎng)基）稀釋1μl lipofectamin試劑（DNA轉(zhuǎn)染時(shí)，則加入2μllipofectamin試劑），輕輕混勻，室溫放置5分鐘；

5、將稀釋好的siRNA和lip2000試劑混合；輕柔混勻，室溫放置20分鐘,以便形成siRNA/lipofectamin（或DNA/lipofectamin）復(fù)合物。
6、將100μl siRNA/lipofectamin（或DNA/lipofectamin）復(fù)合物加到含有細(xì)胞和培養(yǎng)基的培養(yǎng)板的孔中，來(lái)回輕柔搖晃細(xì)胞培養(yǎng)板板。
7、 細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱中37℃溫育24h-48h后，進(jìn)行轉(zhuǎn)染后的其它檢測(cè)步驟。如果細(xì)胞株比較敏感，孵育4-6小時(shí)后，除去復(fù)合物，更換培養(yǎng)基。  


G．懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染程序

1、轉(zhuǎn)染的當(dāng)天，收集細(xì)胞離心，用含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基重懸。
2、在50μl的DMEM（或Opti-MEM，或其他無(wú)血清培養(yǎng)基）無(wú)血清的培養(yǎng)基加入20pmol siRNA(或0.8μg DNA)，柔和混勻；
3、混勻lipofectamin試劑，用50μl無(wú)血清的DMEM或Opti-MEM，或其他無(wú)血清培養(yǎng)基）稀釋1μl lipofectamin試劑（DNA轉(zhuǎn)染時(shí)，則加入2μl lipofectamin試劑），輕輕混勻，室溫放置5分鐘；
4、將稀釋好的siRNA和lipofectamin試劑混合；輕柔混勻，室溫放置20分鐘,以便形成siRNA/lipofectamin（或DNA/lipofectamin）復(fù)合物。
5、再加入400μL細(xì)胞懸浮液（細(xì)胞數(shù)量決定于細(xì)胞類(lèi)型和轉(zhuǎn)染后分析測(cè)試的時(shí)間）。
6、細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱中37℃溫育24h-48h后，進(jìn)行轉(zhuǎn)染后的其它檢測(cè)步驟。如果細(xì)胞株比較敏感，孵育4-6小時(shí)后，除去復(fù)合物，更換培養(yǎng)基。  



H．DNA和siRNA共轉(zhuǎn)染細(xì)胞

1、在轉(zhuǎn)染的前一天，4-5′104細(xì)胞接種在24孔板上，0.5 mL含F(xiàn)BS和抗生素的細(xì)胞培養(yǎng)基。
2、選擇用于初期接種的細(xì)胞密度，應(yīng)能在24小時(shí)內(nèi)使細(xì)胞匯合達(dá)到70-90%。
3、在100μL的無(wú)血清的培養(yǎng)基中稀釋20pmol siRNA和0.2μg DNA，加入2μl lipofectamin試劑，充分混合，放置20分鐘,以便形成siRNA/ DNA/lipofectamin復(fù)合物。
4、將siRNA/ DNA/lipofectamin復(fù)合物加入培養(yǎng)基中，輕輕混勻。
5、細(xì)胞在37℃溫育24h-48h后，進(jìn)行轉(zhuǎn)染后的其它步驟。


I．siRNA體內(nèi)導(dǎo)入方法

1、適量的siRNA或DNA溶于不含RNA酶的無(wú)菌水中，輕輕混勻，因?yàn)樽⑸湟后w積有限，建議采用高濃度的siRNA或DNA，一般DNA為2μg /μL、siRNA為10μg /μL。
2、取適量的DNA、siRNA或siRNA\DNA復(fù)合物與lipofectamin混合。例如，在1#管中加入0.5μL的DNA（1μg）和0.5μL的siRNA（5μg），在2#管中加入0.55μL的lipofectamin（24μg）和0.45μL不含RNA酶的無(wú)菌水中，將1#管中的溶液加入2#管中，在室溫下溫育30分鐘，以形成siRNA/DNA-lipofectamin復(fù)合物。
3、制備的siRNA/DNA-lipofectamine復(fù)合物可用于體內(nèi)導(dǎo)入siRNA、DNA或siRNA\DNA。

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

相關(guān)文獻(xiàn)

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1. RNA干擾研究工具
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承諾保證

l?常規(guī)siRNA套餐（人、大、小鼠mRNA A/B/C/D/E/F 套餐）：

轉(zhuǎn)染效率良好的情況下（>80%），保證mRNA水平70%干擾效果（下限偏差不超過(guò)5%），無(wú)效可以免費(fèi)重新提供一次靶點(diǎn)，如果重新合成后再次無(wú)效或退票退款或做預(yù)付款；

l?特殊物種或lncRNA套餐：

lncRNA或者非人鼠的其他哺乳動(dòng)物的mRNA，只接受一次無(wú)效投訴，需款到后發(fā)送重合產(chǎn)品，如果重新合成后再次無(wú)效，則不再接受投訴處理。

l?針對(duì)circRNA干擾序列設(shè)計(jì)，由于其設(shè)計(jì)靶點(diǎn)局限性，我們針對(duì)目的基因設(shè)計(jì)3對(duì)干擾靶點(diǎn)。如果客戶(hù)檢測(cè)無(wú)效且已付款，且客戶(hù)可以接受在非環(huán)化位點(diǎn)設(shè)計(jì)的情況下，我們可以免費(fèi)重新設(shè)計(jì)3對(duì)。如果再次無(wú)效則不再免費(fèi)重做。目前我們成功率大約在85%左右。（如果需要我們做驗(yàn)證1株細(xì)胞1個(gè)circRNA服務(wù)：驗(yàn)證分組3個(gè)干擾靶點(diǎn)組，一個(gè)陰性對(duì)照組，空白細(xì)胞組，在一株細(xì)胞驗(yàn)證2個(gè)時(shí)間點(diǎn)1萬(wàn)，預(yù)付5仟，如果無(wú)效，只收預(yù)付款。如果需要重新設(shè)計(jì)到該基因其他位置驗(yàn)證，則收取全款。如果無(wú)效也不再退款）

對(duì)于circRNA產(chǎn)品線(xiàn)，目前不保證100%一定成功。

備注：以上信息為常規(guī)承諾與處理無(wú)效信息，對(duì)于經(jīng)客戶(hù)與公司雙方特殊約定信息除外。

所有產(chǎn)品僅限用于科研實(shí)驗(yàn)，僅針對(duì)細(xì)胞水平，體內(nèi)效果由于影響因素較多，不做任何體內(nèi)效果保證。

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