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特殊化學修飾siRNA
RNAi技術的最大難題就是化學合成siRNA穩定性問題。GenePharma化學修飾stableTMsiRNA作用時間長，比標準的siRNA的作用時間延長一倍左右。GenePharma化學修飾stableTMsiRNA不僅增強了在血清和細胞培養中的壽命，而且加強了在離體條件下的應用能力。
RNAi技術的最大難題就是化學合成siRNA穩定性問題。GenePharma化學修飾stableTMsiRNA最大的目標就是一次性獲得最佳的實驗數據。我們的方法就是使用RNAi－Mate轉染試劑將化學修飾stableTMsiRNA導入哺乳動物細胞中，獲得如下滿意結果：
1、高效的基因沉默
2、高穩定性—在血清和培養基中
3、最大限度減少副作用
4、更長的作用時間
化學修飾stableTMsiRNA oligo與普通的siRNA oligo性能對照表
| 關鍵難題 | 標準的siRNA | 化學修飾stableTMsiRNA |
| siRNA 降解 | 標準的非修飾的siRNA在細胞培養過程中很容易降解，雖然在大部分的離體實驗中是有效的，但是在細胞培養中壽命較短。 | GenePharma化學修飾stableTMsiRNA不僅增強了在血清和細胞培養中的壽命，而且加強了在離體條件下的應用能力。 |
| 作用時效 | 作用時間較短，一般情況下為1-3天。 | GenePharma化學修飾stableTMsiRNA作用時間長，比標準的siRNA的作用時間延長一倍左右。 |
| 活體應用的活性 | 標準的siRNA穩定性較差，一般不適用于體內試驗。 | GenePharma化學修飾stableTMsiRNA在體內的穩定性強。 |
GenePharma 提供的siRNA 修飾方式
吉瑪提供高純度的siRNA。可提供選擇的標記和修飾方式包括如下：
注：價格只是修飾費用，不包括RNA合成費用，oligo規格為OD數，價格單位為人民幣：元.
| 5'端修飾 | 純化方式 | 規格 | 價格 |
| Thiol | HPLC | 5 OD以內 | 300 |
| biotin | HPLC | 5 OD以內 | 300 |
| biotin-teg | HPLC | 5 OD以內 | 400 |
| chol | HPLC | 5 OD以內 | 300 |
| HEX | HPLC | 5 OD以內 | 300 |
| TET | HPLC | 5 OD以內 | 300 |
| FAM | HPLC | 5 OD以內 | 300 |
| CY3 | HPLC | 5 OD以內 | 300 |
| CY5 | HPLC | 5 OD以內 | 500 |
| C6-NH2-TFA | HPLC | 5 OD以內 | 300 |
| C6-NH2-MMT | HPLC | 5 OD以內 | 300 |
| C6-NH2-PDA | HPLC | 5 OD以內 | 300 |
| TAMRA | HPLC | 5 OD以內 | 300 |
| PHOS | HPLC | 5 OD以內 | 300 |
| Hexynl | HPLC | 5 OD以內 | 300 |
| CFR610 | HPLC | 5 OD以內 | 300 |
| 3'端修飾 | 純化方式 | 規格 | 價格 |
| C7-NH2 | HPLC | 5 OD以內 | 200 |
| chol | HPLC | 5 OD以內 | 300 |
| BHQ-1 | HPLC | 5 OD以內 | 200 |
| BHQ-2 | HPLC | 5 OD以內 | 200 |
| DABCYL | HPLC | 5 OD以內 | 200 |
| FAM | HPLC | 5 OD以內 | 300 |
| CY3 | HPLC | 5 OD以內 | 300 |
| CY5 | HPLC | 5 OD以內 | 500 |
| Thiol | HPLC | 5 OD以內 | 300 |
| TAMRA | HPLC | 5 OD以內 | 300 |
| biotin | HPLC | 5 OD以內 | 300 |
| biotin-teg | HPLC | 5 OD以內 | 400 |
| ddC | HPLC | 5 OD以內 | 300 |
| ?GALNAC | HPLC | 5 OD以內 | 500 |
| PHOS | HPLC | 5 OD以內 | 300 |
| MGB | HPLC | 5 OD以內 | 400 |
| CFR610 | HPLC | 5 OD以內 | 300 |
| 中間體修飾(CEPA類) | 純化方式 | 規格 | 價格 |
| spacer 18(PEG) | HPLC | 5 OD以內 | 200 |
| spacer 9 | HPLC | 5 OD以內 | 200 |
| SE(鎖核酸） | HPLC | 5 OD以內 | 300 |
| 2'-ome | HPLC | 5 OD以內 | 100 |
| 2'-F | HPLC | 5 OD以內 | 100 |
| rI | HPLC | 5 OD以內 | 200 |
| dI | HPLC | 5 OD以內 | 200 |
| 5-Me-dC | HPLC | 5 OD以內 | 200 |
| 4’-Thiol-dU CEPA? | HPLC | 5 OD以內 | 200 |
| idT-CEPA | HPLC | 5 OD以內 | 200 |
| 2'-MOE | HPLC? | 5 OD以內 | 200 |
| ?????Gemcitabine | HPLC | 5 OD以內 | 200 |
| Spacer C3 | HPLC | 5 OD以內 | 200 |
| ? 序列修飾 | 純化方式 | 規格 | 價格 |
| ?ASO修飾 | HPLC | 5 OD以內 | 詢價 |
| ESC修飾 | HPLC | 5 OD以內 | 詢價 |
| PS修飾 | HPLC | 5 OD以內 | 詢價 |
本公司提供的siRNA相關產品直接作用于靶基因mRNA，因此我們建議您在收到我們的相關產品后先進行實時定量PCR檢測，以確定靶基因mRNA表達水平的變化，進而直接確認我們合成或構建的siRNA產品是否有效。
RNAi活體研究（In vivo RNAi）
在培養的哺乳動物細胞中，RNA干擾已經廣泛應用于基因功能的研究。雖然RNAi干擾已經在體外（in vitro）研究中成為一個強大的研究方法，但是我們還是要著眼于將基因功能的研究放在整體生物中進行評價。為此，研究人員現在應用RNAi活體研究（RNAi in vivo）的方法來進行研究。雖然此項研究還處于早期，但是活體RNAi用已經越來越廣使用并取得了不少進展。目前在活體研究中的兩個基本方法：
1. 化學合成的siRNA?
2. 質粒或者病毒載體的方法
化學合成方法容易合成，成本低，轉染效率高，目前已經廣泛應用于活體研究，質粒和病毒相對而言難于構建合成，并且經常有突變，轉染效率低，有免疫原性等缺點。在活體水平，siRNA成功調控基因的成麼主要依賴于有效的傳遞方式，特異靶組織的siRNA富集濃度，siRNA的穩定性。目前已經有多報道應用局部注射或者全身性給藥的方式，siRNA成功抑制基因表達。
吉瑪化學修飾的stableTM siRNA已經成功應用于活體研究。
吉瑪提供多種修飾方式的siRNA滿足客戶活體水平基因功能研究。我們的單體的修飾方式有2’-F, 2’-Ome，磷酸化修飾，膽固醇修飾，巰基修飾等。我們in vivo siRNA經過離子交換式的HPLC純化，純度>95%以上。
| 目錄號 | 產品說明 | 規格 | 純化方式 | 價格 | 交貨期限 |
| A02004 | Chemically modified siRNA | 4 OD | HPLC | ￥600 | 6個工作日 |
| A02005 | Chemically modified siRNA | 5 OD | HPLC | ￥700 | 6個工作日 |
| A02010 | Chemically modified siRNA | 10OD | HPLC | ￥1300 | 6個工作日 |
| A02025 | Chemically modified siRNA | 25OD | HPLC | 詢價? |
詢問 |
| A02050 | Chemically modified siRNA | 50OD | HPLC | ￥5000 | 6個工作日 |
| A02100 | Chemically modified siRNA | 100OD | HPLC | ￥6500 | 8個工作日 |
| A02250 | Chemically modified siRNA | 250OD | HPLC |
詢價? |
詢問 |
siRNA Real-Time PCR結果分析
對于RNAi實驗而言，我們通常需要知道的是某一特定細胞在導入siRNA前后某一特定基因的表達變化情況來判斷siRNA起到了Gene Knockdown作用。應用熒光定量PCR的方法，可以通過兩種途徑來實現上述判斷，一是測定特定細胞在導入siRNA前后某一特定基因mRNA數量的變化，即為絕對定量；二是通過檢測特定基因與某一管家基因在在導入siRNA前后相對表達情況的變化，即為相對定量。通常采用相對定量的方法來檢測siRNA的Gene Knockdown作用。
1．Real-Time PCR 實驗設計
Real-Time PCR實驗設計時應包括實驗組（導入siRNA），陰性對照（Negative Control）和Mock Transfaction三組。每組至少三個重復。各組同時檢測目標基因和管家基因的Ct值。下例中以GAPDH為管家基因。
各組重復實驗的Ct值差異不能過大；一般地，重復實驗Ct值差異在1以內是可以接受的。
| 實驗組 | 陰性對照（NC） | Mock Transfection | |||||||
| Target Gene | GAPDH | Target Gene | GAPDH | Target Gene | GAPDH | ||||
| 30.40 | 23.63 | 24.21 | 22.66 | 26.21 | 24.60 | ||||
| 30.35 | 23.40 | 24.60 | 22.56 | 26.15 | 24.31 | ||||
| 30.41 | 23.52 | 24.66 | 22.48 | 26.35 | 24.72 | ||||
以Mock Tansfection為對照（Calibrator），管家基因為Normalizer，ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)實驗組－( Ct目的基因- Ct管家基因)對照
| Target Gene | GAPDH | ΔCt | ΔΔCt | Target Gene | |
| Average Ct | Average Ct | Target Gene–GAPDH | ΔCt–ΔCt, Mock | Rel. to Mock | |
| Mock | 26.24±0.10 | 24.54±0.21 | 1.7±0.21 | 0.00±0.21 | 1.0(1.16－0.86) |
| 實驗組 | 30.39±0.09*1 | 23.51±0.15*2 | 6.88±0.17*3 | 5.18±0.17 | 0.027(0.024?0.031) |
| NC | 24.49±0.24 | 22.56±0.09 | 1.93±0.25 | 0.23±0.25 | 0.85(0.71－1.01) |
|
注：*1 為同一樣本重復實驗的Ct值的標準偏差，可用Excel 計算得到；? *2 計算公式為 ，例如 ＝0.17 *3 計算公式為2－△△Ct+S 和2－△△Ct－S，S為△△Ct的標準偏差，例如 2－(－2.5+0.10) ＝5.3 |
|||||
siRNA轉染的方法
哺乳動物轉染的常見方法有：磷酸鈣共沉淀、電穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene、機械法（例如,顯微注射和基因槍）、陽離子脂質體試劑，其中陽離子脂質體試劑轉染法是目前最常用的轉染方法。
應用脂質體型轉染試劑進行轉染需要注重的幾個方面：轉染試劑的用量、siRNA的用量、轉染時的細胞密度、轉染時的操作順序、細胞與轉染試劑/siRNA復合物的溫浴的時間。
A. GP-transfect-Mate 操作流程（24 孔板）
以24 孔板為例，若要檢測基因沉默或者過表達效果，推薦最低RNA oligo終濃度為50nM
（DNA為0.5~1.5μg）；遵循以下操作方法可以高效地將RNA oligo或者DNA轉染貼壁和懸浮培養的多種真核細胞。但是對某些特殊的細胞系和培養條件，或特殊應用等，也需要單獨特別優化，請參考表 1、表2。
1. 細胞鋪板
轉染時細胞密度：一般來說，當細胞密度達到60%～80%時進行轉染可以取得較高的轉染效率(參見表1)。然而，不同細胞的最適轉染密度都不盡相同，因此在初次轉染某種細胞時，可以通過預實驗先確認該細胞最佳的轉染密度。
2. 轉染復合物的制備
（1）將 GP-transfect-Mate轉染試劑放置于室溫中，使用前輕輕混勻。
（2）在1.5 ml無菌離心管中加入50 μl無血清培養基或 OPTI-MEM，并添加適量的轉染試劑(參見表2)，用移液器輕輕混勻，室溫靜置5 min。
（3）同時在另一1.5 ml無菌離心管中加入50 μl無血清培養基或 OPTI-MEM，并添加適量的RNA oligo/DNA (參見表2)，用移液器輕輕混勻，室溫靜置5 min。
（4）將GP-transfect-Mate-培養基混合物滴加至RNA oligo/DNA-培養基混合物中，用移液器輕輕混勻，室溫靜置15-20 min 后，立即轉染。
注：復合物盡量在60 min內使用，并且GP-transfect-Mate-培養基混合物和RNA oligo/DNA-培養基混合物的混合次序非常重要，切勿顛倒。
3. 轉染過程
（1）趁靜置時，給 24 孔板換液，每孔換上 0.4ml 預熱的新鮮培養基。
（2）將 100 μl 轉染混合物加入孔中，終體系為500 μl。加完后將板輕輕晃動以使復合物均勻分布。
（3）37℃靜置培養細胞，4-6h換成完全培養基。24-72 h檢測mRNA表達，48-96 h檢測蛋白表達。
適用范圍
293T, A549, Beas-2B,HeLa,ECA-109,Raw264.7,A375,CAFs,HCT116,HT29,LMH,NE-4C,MGC803，PC-3, PC-12，MCF-7,C6等細胞。
表 1: 貼壁細胞或懸浮細胞接種數量、培養基體積
|
培養器皿 |
每孔表面積（cm2） |
每孔培養基的體積（ml） |
貼壁細胞轉染前一天接種密度 |
懸浮細胞轉染當天接種密度 |
|
|
96 孔板 |
0.3 |
0.1 |
5 000±2 500 |
2-5×104 |
|
|
24 孔板 |
2 |
0.5 |
25000±10 000 |
1-2.5×105 |
|
|
12 孔板 |
4 |
1 |
50000±20 000 |
2-5×105 |
|
|
6 孔板 |
10 |
2 |
150000±50 000 |
0.4-1×106 |
|
|
60mm |
20 |
4 |
400000±100 000 |
1-2.5×106 |
|
|
100mm |
60 |
10 |
1*106±250 000 |
2-5×106 |
|
注：貼壁細胞培養密度取決于培養器皿的表面積，而懸浮細胞則由培養基的體積決定。
表 2 不同培養板轉染DNA/RNA oligo的推薦轉染條件
|
培養器皿 |
Growth Medium |
Opti-MEM/ Serum-free Mediumfor complex |
DNA 轉染 |
RNA轉染 |
||
|
DNA/μg |
轉染試劑/μl |
RNA/pmol |
轉染試劑/μl |
|||
|
96 孔板 |
100 μl |
2×10μl |
0.2 |
0.4-1 |
20 |
0.5-1 |
|
24 孔板 |
500 μl |
2×50μl |
0.6 |
1.2-3 |
40 |
1-3 |
|
12 孔板 |
1ml |
2×100μl |
1.5 |
3-6 |
80 |
3-5 |
|
6 孔板 |
2 ml |
2×200 μl |
3 |
6-12.5 |
150 |
5-8 |
|
60mm |
5ml |
2×500 μl |
6-10 |
12-20 |
300 |
10-20 |
|
100mm |
10 ml |
2×1ml |
15-30 |
30-60 |
500 |
25-35 |
注：GP-transfect-Mate轉染試劑的用量在此范圍內進行優化。
B．Lipofectamin2000 轉染試劑
選擇最適合的轉染試劑和轉染條件，往往取決于不同的哺乳動物細胞類型和不同的核酸分子。Lipofectamin2000適用于核酸的體內和體外操作，可應用于DNA、RNA、反義寡核苷酸、siRNA的轉染，也可應用于DNA/siRNA的共轉染操作；是一種新型的高效siRNA轉染試劑。
Lipofectamin2000的應用領域：
1、原代培養細胞和轉化細胞株的基因轉染
2、siRNA高通量轉染試驗
3、DNA轉染；DNA和siRNA的共轉染
4、核酸（siRNA、DNA、RNA）的體內導入試驗
5、貼壁細胞和懸浮細胞轉染
Lipofectamin2000 的特點：
1、不必更換培養基，操作簡便易行，可在半小時內完成操作
2、在含血清培養基中也能表現高轉染效率
3、細胞毒性低；適用細胞廣泛
4、即用型試劑，可在含有抗生素的完全培養基中轉染
5、基于脂質的轉染試劑，確保沒有RNAse活性
6、可介導siRNA高轉染細胞及體內siRNA的高效導入
C. Lipofectamin2000適用的細胞類型
Lipofectamin2000轉染試劑可廣泛應用于多種細胞系的DNA和siRNA轉染如：HeLa(人頸部癌細胞)、MCF-7(人乳房癌細胞)、Hep3B(人肝細胞癌細胞)、COS-7(猴腎細胞)、Neuro-2a(鼠神經母細胞瘤細胞)、NIKS(人角質化細胞)、B16(鼠黑素瘤細胞)、DLD-1(人結腸癌細胞)、NIH/3T3(鼠胚胎成纖維細胞)、HT-29(人結腸腺癌細胞)、A549(人肺癌細胞)、CHO-k1(倉鼠卵巢細胞)和293(腺病毒5 DNA轉化的人胚胎腎細胞),SVRbag4細胞等。
D．轉染前細胞培養
在細胞板上培養細胞時，應使細胞匯合在24小時內達到70-90%。
E．合適的lipofectamin2000用量
合適的siRNA(DNA)：lipofetamin2000比例對核酸的高效轉染有重要影響；我們推薦的DNA：lipofetamin2000為1：0.5—1：5（ug:ul），siRNA：lipofectamin2000為1：0.01-1：0.1（pmol：ul）一般情況下，此范圍內都可獲得高的轉染效率。
F．貼壁細胞轉染程序
選用生理狀態良好的細胞對提高轉染效率很重要。siRNA(DNA)和lipofectamin的用量和兩者的比例可在推薦范圍內適當調整。
1、轉染前一天，4-5′104細胞接種在24孔板上， 0.5mL含FBS和抗生素的DMEM（或Opti-MEM，其他培養基）細胞培養基。
2、選擇用于初期接種的細胞數量，應能在24小時內使細胞匯合達到70-90%。
3、在50μl的DMEM（或Opti-MEM，或其他無血清培養基）無血清培養基加入20pmol siRNA(或0.8μg DNA)，柔和混勻；
4、混勻lipofectamin試劑，用50μl無血清的DMEM或Opti-MEM，或其他無血清培養基）稀釋1μl lipofectamin試劑（DNA轉染時，則加入2μllipofectamin試劑），輕輕混勻，室溫放置5分鐘；
5、將稀釋好的siRNA和lipofectamin試劑混合；輕柔混勻，室溫放置20分鐘,以便形成siRNA/lipofectamin（或DNA/lipofectamin）復合物。
6、將100μl siRNA/lipofectamin（或DNA/lipofectamin）復合物加到含有細胞和培養基的培養板的孔中，來回輕柔搖晃細胞培養板板。
7、 細胞在CO2培養箱中37℃溫育24h-48h后，進行轉染后的其它檢測步驟。如果細胞株比較敏感，孵育4-6小時后，除去復合物，更換培養基。
G．懸浮細胞轉染程序
1、轉染的當天，收集細胞離心，用含FBS的培養基重懸。
2、在50μl的DMEM（或Opti-MEM，或其他無血清培養基）無血清的培養基加入20pmol siRNA(或0.8μg DNA)，柔和混勻；
3、混勻lipofectamin試劑，用50μl無血清的DMEM或Opti-MEM，或其他無血清培養基）稀釋1μl lipofectamin試劑（DNA轉染時，則加入2μl lipofectamin試劑），輕輕混勻，室溫放置5分鐘；
4、將稀釋好的siRNA和lipofectamin試劑混合；輕柔混勻，室溫放置20分鐘,以便形成siRNA/lipofectamin（或DNA/lipofectamin）復合物。
5、再加入400μL細胞懸浮液（細胞數量決定于細胞類型和轉染后分析測試的時間）。
6、細胞在CO2培養箱中37℃溫育24h-48h后，進行轉染后的其它檢測步驟。如果細胞株比較敏感，孵育4-6小時后，除去復合物，更換培養基。
H．DNA和siRNA共轉染細胞
1、在轉染的前一天，4-5′104細胞接種在24孔板上，0.5 mL含FBS和抗生素的細胞培養基。
2、選擇用于初期接種的細胞密度，應能在24小時內使細胞匯合達到70-90%。
3、在100μL的無血清的培養基中稀釋20pmol siRNA和0.2μg DNA，加入2μl lipofectamin試劑，充分混合，放置20分鐘,以便形成siRNA/ DNA/lipofectamin復合物。
4、將siRNA/ DNA/lipofectamin復合物加入培養基中，輕輕混勻。
5、細胞在37℃溫育24h-48h后，進行轉染后的其它步驟。
I．siRNA體內導入方法
1、適量的siRNA或DNA溶于不含RNA酶的無菌水中，輕輕混勻，因為注射液體積有限，建議采用高濃度的siRNA或DNA，一般DNA為2μg /μL、siRNA為10μg /μL。
2、取適量的DNA、siRNA或siRNA\DNA復合物與lipofectamin混合。例如，在1#管中加入0.5μL的DNA（1μg）和0.5μL的siRNA（5μg），在2#管中加入0.55μL的lipofectamin（24μg）和0.45μL不含RNA酶的無菌水中，將1#管中的溶液加入2#管中，在室溫下溫育30分鐘，以形成siRNA/DNA-lipofectamin復合物。
3、制備的siRNA/DNA-lipofectamine復合物可用于體內導入siRNA、DNA或siRNA\DNA。
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1. RNA干擾研究工具
2. MicroRNA研究工具?
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