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公司產(chǎn)品
shRNA質(zhì)粒載體
shRNA表達(dá)載體帶有抗生素標(biāo)記，可以在細(xì)胞中持續(xù)抑制靶基因的表達(dá)，持續(xù)數(shù)星期甚至更久。對于一個(gè)已知有效的siRNA序列（例如，經(jīng)過siRNA合成方法篩選獲得的），需要維持較長時(shí)間的基因沉默時(shí)，推薦使用shRNA載體系統(tǒng)。
shRNA表達(dá)載體帶有抗生素標(biāo)記，可以在細(xì)胞中持續(xù)抑制靶基因的表達(dá)，持續(xù)數(shù)星期甚至更久。對于一個(gè)已知有效的siRNA序列（例如，經(jīng)過siRNA合成方法篩選獲得的），需要維持較長時(shí)間的基因沉默時(shí)，推薦使用shRNA載體系統(tǒng)。吉瑪致力于提供最先進(jìn)和最方便的shRNA相關(guān)工具，最近推出新一代shRNA表達(dá)質(zhì)粒，一種高效即用型載體，該載體在細(xì)胞內(nèi)可以持續(xù)產(chǎn)生shRNAs，從而達(dá)到持久抑制目標(biāo)基因表達(dá)的目的。
吉瑪 supersilencingTM shRNA表達(dá)載體系統(tǒng)
shRNA表達(dá)載體系統(tǒng)特點(diǎn)：
產(chǎn)生短發(fā)夾型RNA（shRNA）來完成RNA干擾
方法簡單、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，只需合成DNA寡核苷酸克隆載體使用方便，帶有篩選標(biāo)記
克隆載體使用方便，帶有篩選標(biāo)記
shRNA質(zhì)粒穩(wěn)定，易于操作
GenePharma supersilencingTM shRNA表達(dá)載體特點(diǎn)：
1、克隆載體具有兩種形式的克隆酶切位點(diǎn)BbsⅠ和 BamHⅠ。
BbsⅠ是特殊的限制性內(nèi)切酶，產(chǎn)生非對稱互補(bǔ)粘性末端，保證插入片斷的方向正確，防止載體自體連接。
2、shRNA多種篩選標(biāo)記可幫助建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系
Neo ：Neomycin耐受基因
Hygro ：Hygromycin B 耐受基因
GFP：GFP報(bào)告基因
RFP：RFP報(bào)告基因
報(bào)告基因GFP/RFP可以幫助評價(jià)轉(zhuǎn)染效率和指示RNAi發(fā)生位點(diǎn)
本公司共可構(gòu)建11種RNAi Vector，分別為pGPU6, pGPH1, pGPU6/Neo, pGPH1/Neo, pGPU6/Hygro, pGPH1/Hygro, pGPU6/GFP/Neo, pGPH1/GFP/Neo，pGPU6/RFP/Neo, pGPH1/RFP/Neo,pGPU6/mCherry/Puro。
其中pGPU6, pGPH1為無篩選標(biāo)記RNAi載體；
pGPU6/Neo, pGPH1/Neo, pGPU6/Hygro, pGPH1/Hygro為含抗性篩選標(biāo)記Neomycin和Hygromycin的RNAi載體；
pGPU6/GFP/Neo, pGPH1/GFP/Neo分別為含抗性篩選標(biāo)記Neomycin同時(shí)可以表達(dá)GFP蛋白的RNAi載體；
pGPU6/RFP/Neo, pGPH1/RFP/Neo分別為含抗性篩選標(biāo)記Neomycin同時(shí)可以表達(dá)RFP蛋白的RNAi載體。
11種RNAi Vector載體圖譜如下：
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每套載體均包括線狀或環(huán)狀shRNA表達(dá)載體，并為您提供整體的解決方案。 |
| 套裝組成 | 數(shù)量 |
| 針對目的基因的shRNA載體 | 4個(gè) |
| 陽性對照shRNA載體 | 1個(gè) |
| 陰性對照shRNA載體 | 1個(gè) |
| 注：套裝中所有質(zhì)粒提供量為50ug | |
| 目錄號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | 價(jià)格 | 交貨期限 |
| C01001 | SuperSilencing? shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體套裝> | 1 套 | ￥2,600 | 2周 |
| 目錄號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | 價(jià)格 | 交貨期限 |
| C03001 | GAPDH SuperSilencing shRNA? 質(zhì)粒表達(dá)載體 | 50ug | ￥199 | 1周 |
| C03002 | Negative Control SuperSilencing shRNA? 質(zhì)粒表達(dá)載體 | 50ug | ￥199 | 1周 |
我們可以幫您將編碼目標(biāo)shRNA 的DNA插入質(zhì)粒，并做序列正確性檢測，您只需告訴我們靶基因序列或Gene ID號(hào)和希望插入載體的名稱，我們來幫您構(gòu)建。我們?yōu)槟峁┳銐蚴褂玫募兓木幋a您的目的shRNA的表達(dá)質(zhì)粒。
| 目錄號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | 價(jià)格 | 交貨期限 |
| C02001 | ShRNA質(zhì)粒表達(dá)載體 (pGPU6) | 50μg | ￥599 | 2周 |
| C02002 | ShRNA質(zhì)粒表達(dá)載體 (pGPH1) | 50μg | ￥599 | 2周 |
| C02003 | ShRNA質(zhì)粒表達(dá)載體 (pGPU6/Neo) | 50μg | ￥599 | 2周 |
| C02004 | ShRNA質(zhì)粒表達(dá)載體 (pGPH1/Neo) | 50μg | ￥599 | 2周 |
| C02005 | ShRNA質(zhì)粒表達(dá)載體 (pGPU6/Hygro) | 50μg | ￥599 | 2周 |
| C02006 | ShRNA質(zhì)粒表達(dá)載體 (pGPH1/Hygro) | 50μg | ￥599 | 2周 |
| C02007 | ShRNA質(zhì)粒表達(dá)載體 (pGPU6/GFP/Neo) | 50μg | ￥599 | 2周 |
| C02008 | ShRNA質(zhì)粒表達(dá)載體 (pGPH1/GFP/Neo) | 50μg | ￥599 | 2周 |
| C02009 | ShRNA質(zhì)粒表達(dá)載體 (pGPU6/RFP/Neo) | 50μg | ￥599 | 2周 |
| C02010 | ShRNA質(zhì)粒表達(dá)載體 (pGPH1/RFP/Neo ) | 50μg | ￥599 | 2周 |
如果您選擇吉瑪公司的Validated SuperSilencing shRNATM 質(zhì)粒表達(dá)載體，吉瑪提供配套的陰性對照質(zhì)粒，陰性對照質(zhì)粒是RNA干擾試驗(yàn)所必須的，一個(gè)好的GAPDH陽性對照載體，可以讓您試驗(yàn)體系更加穩(wěn)定，也可以檢測試驗(yàn)中可能出現(xiàn)的問題。
客戶將siRNA片段克隆到目的表達(dá)載體后，需制備大量高純度或無內(nèi)毒素的質(zhì)粒進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，為此吉瑪公司推出制備高純度質(zhì)粒的服務(wù)。
shRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)實(shí)例
一、 細(xì)胞培養(yǎng)
人胚腎細(xì)胞293T，常規(guī)培養(yǎng)使用含10% FBS (Gibco)的DMEM培養(yǎng)基(Gibco)(含1.5 mM L-Glutamine, 3.7 g/L NaHCO3, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml Streptomycin)中，37oC 5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
二、 GAPDH siRNA片段的設(shè)計(jì)與合成
人GAPDH的干擾序列信息見表1。實(shí)驗(yàn)所用shRNA的設(shè)計(jì)由吉瑪公司（GenePharma, Shanghai）提供服務(wù)。
表1 GAPDH基因的靶點(diǎn)序列
| shRNA | Strand | sequence |
| GAPDH | target | |
| NC | 5'- UUCUCCGAACGUGUCACGU -3 |
寡核苷酸的設(shè)計(jì)
shRNA模板中的loop結(jié)構(gòu)選用了TTCAAGAGA以避免形成終止信號(hào)，shRNA的轉(zhuǎn)錄終止序列采用T6結(jié)構(gòu)。正義鏈模板的5'端添加了CACC，與BbsI酶切后形成的粘端互補(bǔ)；反義鏈模板的5'端添加了GATC，與BamHI酶切后形成的粘端互補(bǔ)；如果siRNA的第一個(gè)堿基不是G，則在CACC后補(bǔ)加一個(gè)G。
Negative Control-S:
5'-CACC GTTCTCCGAACGTGTCACGT TTCAAGAGA ACGTGACACGTTCGGAGAA TTTTTT G-3'
Negative Control- AS:
5'-GATC CAAAAAA TTCTCCGAACGTGTCACGT TCTCTTGAA ACGTGACACGTTCGGAGAAC-3'
pGPU6/GFP/Neo-shRNA載體的構(gòu)建
1. 按照如下體系進(jìn)行載體的連接反應(yīng)：
| Components | Volume (ul) |
| 10×T4 Ligation Buffer | 2 |
| pGPU6/GFP/Neo(Bbs?I+BamH I) | 1 |
| shRNA template( 20nM) | 1 |
| T4 DNA ligase( 5 weissU/ul) | 1 |
| ddH2O | 15 |
| Total | 20 |
2.? 22℃ 反應(yīng)1hr, 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中。
3.?每個(gè)連接反應(yīng)挑取5個(gè)菌落，接種到含50 ug/ml Kanamycin的LB培養(yǎng)集中。
4. 使用堿裂解法抽提質(zhì)粒，所得質(zhì)粒用BamH I, Pst I分別酶切鑒定。5. 陽性重組載體送去測序。
三、 shRNA質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染
實(shí)驗(yàn)材料及試劑
DMEM培養(yǎng)基+10% FBS
D-Hank's Solution
Trypsin-EDTA Solution (0.25% Trypsin +0.53 mM EDTA, Hyclone)
Lipofectamin2000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen）
Opti-MEM I Reduced serum medium(Gibco)
無抗生素的DMEM培養(yǎng)基
12孔板 （Corning）
步驟
1. 293T細(xì)胞在10 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至80-90%融合時(shí)，接種12孔板。
2. 傾去培養(yǎng)液，用5 ml D-Hank's solution洗滌細(xì)胞兩次。
3. 加入2 ml Trypsin-EDTA solution, 混勻后，37oC放置3-5分鐘。
4. 小心吸去胰酶溶液，在加入2 ml 含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，吹打使細(xì)胞形成單細(xì)胞懸液。
5. 血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將細(xì)胞稀釋至5×105細(xì)胞/ml。
6. 按2.5×105細(xì)胞/孔的濃度接種12孔板，混勻后于37oC 5% CO2培養(yǎng)24小時(shí)。
7. 在1.5 ml EP管中加入100 μl Opti-MEM I，再加入2μg質(zhì)粒，取另一1.5mlEP管，加入100μl Opti-MEM I，加入4μl Lipofectamin2000，混勻，室溫放置5分鐘后將兩管混合，室溫放置20~30分鐘。
8. 吸去12孔板中的培養(yǎng)液，每孔加入800 μl無血清的DMEM培養(yǎng)液。
9. 將轉(zhuǎn)染混合物逐滴加入12孔板中，混勻后，在培養(yǎng)箱中溫育4-6小時(shí)。
10. 吸棄轉(zhuǎn)染液，加入1ml含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液。37oC 5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)。
11. 所得細(xì)胞用于RNA抽提并進(jìn)行后續(xù)RT-PCR以及Western Blot檢測。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果
以下為細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后48小時(shí)的熒光照片，兩圖為同一視野。轉(zhuǎn)染效率在90%以上。
總RNA的質(zhì)量檢測
轉(zhuǎn)染后24小時(shí)用Trizol法提取抽取細(xì)胞總RNA，所得RNA溶解于DEPC處理的ddH2O中。采用瓊脂糖凝膠電泳分析RNA的完整度，采用分光光度法測定RNA的濃度和純度。實(shí)驗(yàn)中所得樣品的OD260/OD280的值均在1.8-2.0范圍之內(nèi)，并根據(jù)OD260計(jì)算濃度，調(diào)整RNA的濃度為500 ng/μl；瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖2）表示，28S rRNA與18S rRNA的亮度比值約為2：1，說明實(shí)驗(yàn)中所抽提得到的總RNA質(zhì)量較好，無降解，可以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。
轉(zhuǎn)染后24小時(shí)細(xì)胞RNA樣品1，GAPDH干擾組；2，NC；3，Mock；4，Blank
四、 Real-time PCR法檢測RNA干擾效果
4.1 Homo-actin RNA Gene, GAPDH amplification Curves
?Sample.M actin RNA Gene.GAPDH gene amplification plots.
Electrophoresis of GAPDH gene PCR Products:
Marker:50bp
五、 Western blot法檢測RNA干擾效果
結(jié)果與分析
β-actin? ? ? ? ? ??
GAPDH
注：條帶從左至右共4個(gè)條帶，依次為1. 1 2. N 3. M 4. B
表1 第一組Western blot結(jié)果的半定量灰度分析? ? ? ? ? ? ?
| 組別 | ACTIN | GAPDH | GAPDH/ACTIN | rate to mock |
| 1 | 111290 | 8912.81 | 0.080086 | 0.098086 |
| N | 94006.9 | 103993 | 1.106227 | 1.354853 |
| M | 99911.6 | 81577.1 | 0.816493 | 1 |
| B | 71434.8 | 56962.7 | 0.797408 | 0.976626 |
GenePharma shRNA 表達(dá)載體使用說明
?
在使用載體法針對某一基因進(jìn)行 RNＡ干擾 研究過程中，通常會(huì)遇到如下幾個(gè)問題：實(shí)驗(yàn)對照組的確立、細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件的確定、基因抑制效率的檢測。??
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在使用載體法針對某一基因進(jìn)行 RNＡ干擾 研究過程中，通常會(huì)遇到如下幾個(gè)問題：實(shí)驗(yàn)對照組的確立、細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件的確定、基因抑制效率的檢測。??
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1、 實(shí)驗(yàn)對照組的確立在一個(gè)完善的 RNA 干擾實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，必須考慮設(shè)立正確合理的實(shí)驗(yàn)對照組。通常，這些對照組包括陰性對照、陽性對照、轉(zhuǎn)染試劑對照。
陰性對照可以有兩種，一種是采用通用的陰性對照組， 在本試劑盒中包括了該對照所需的載體（shNC），可以表達(dá)與目的基因序列無同源性的 siRNA 片段；另一種是將目的 siRNA 的序列打亂后重新組合所得的陰性對照（scrambled）。
陽性對照組的設(shè)立對于 RNA 干擾研究是很有必要的，尤其對于第一次接觸 RNA 干擾的用 戶而言。您可以利用陽性對照來確認(rèn)RNAi 實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)染、RNA 提取和基因表達(dá)檢測方法的可靠性。陽性對照通常采用已驗(yàn)證的對某些基因有效抑制的 siRNA 片 段。本試劑盒中包括針對人 GAPDH 基因的表達(dá)載體（shGAPDH），該載體在導(dǎo)入細(xì)胞中后，可以有效抑制 GAPDH 基因的表達(dá)。吉瑪還向用戶提供其他的陽性對照以資選擇，詳細(xì)情況請參見本公司的產(chǎn)品目錄或《RNAi 產(chǎn)品使用手冊》。
2、 細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件的確定
使用 DNA 載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，為了選擇合適的轉(zhuǎn)染方法和確定轉(zhuǎn)染效率，通常采用報(bào)告基因來檢測 DNA 的導(dǎo)入情況。最常用的報(bào)告基因是綠色熒光蛋白。吉瑪公司提供的 shRNA 表達(dá)載體有一部分載體中包含綠色熒光蛋白的表達(dá)框架，轉(zhuǎn)入細(xì)胞后可以表轉(zhuǎn)染效率；如果您所定購的載體中不含綠色熒光蛋白的表達(dá)框架，您可以先 使用可 以表達(dá)綠色 熒光蛋 白的表達(dá) 載體來確定 轉(zhuǎn)染效率和轉(zhuǎn)染條件，然后使用同樣的條件來轉(zhuǎn)染 shRNA 表達(dá)載體。
?還用一種方法可以用于 確定轉(zhuǎn)染條件，就是采用陽性對照載體來轉(zhuǎn)染細(xì)胞（如 shGAPDH），檢測對照載體對基因的抑制效率，然后采用抑制效率較高時(shí)的轉(zhuǎn)染條件來進(jìn)一步轉(zhuǎn)染 shRNA 表達(dá)載體。
RNA?干擾實(shí)驗(yàn)操作
由于在 RNA 干擾實(shí) 驗(yàn)中有多 種條件選 擇如試劑 和細(xì)胞 株等，在本實(shí)驗(yàn)操作中以 shNC 為陰性對照，shGAPDH 為陽性對照，RNAi-Mate 為轉(zhuǎn)染試劑，Hela 細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株，按照上述條件分步闡述 RNA 干擾實(shí)驗(yàn)的操作過程。如果用戶使用不同的細(xì)胞株和轉(zhuǎn)染試劑，可根據(jù)吉瑪公司的《RNAi 產(chǎn)品使用手冊》進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。
1??轉(zhuǎn)染條件的確定
如果您所定購的載體中不含綠色熒光蛋白的表達(dá)框架，您可以先 使用可 以表達(dá)綠色 熒光蛋 白的表達(dá) 載體來確定 轉(zhuǎn)染效 率和轉(zhuǎn)染條件，然后使用同樣的條件來轉(zhuǎn)染 shRNA 表達(dá)載體。 還用一種方法可以用于 確定轉(zhuǎn)染條件，就是采用陽性對照載體來轉(zhuǎn)染細(xì)胞（如 shGAPDH），檢測對照載體對基因的抑制效率，然后采用抑制效率較高時(shí)的轉(zhuǎn)染條件來進(jìn)一步轉(zhuǎn)染 shRNA 表達(dá)載體。?
1、轉(zhuǎn)染前一天，接種 0.4-1.0×10 細(xì)胞/孔至 24 孔板中，加入 500μl 含血清培養(yǎng)液，37℃ 5% CO2 培養(yǎng)如果您選用可表達(dá)綠色熒光蛋白 的 pGPU6/GFP/Neo 或pGPH1/GFP/Neo 載體，可以直接用這些載體來確定轉(zhuǎn)染效率；如果選用其他載體，可用其他表達(dá)綠色熒光蛋白的載體來確定轉(zhuǎn)染條件，或使 用 陽 性 對 照 載 體 如shGAPDH 來去 確 定 轉(zhuǎn) 染條件。 選用生理狀態(tài)良好的細(xì)胞對提高 轉(zhuǎn)染效 率很重 要。DNA的用量及其與轉(zhuǎn)染試劑的比例可在 推薦范圍 內(nèi)適當(dāng)調(diào)整。
2、 在 50 μl Opti-MEM I 培養(yǎng)液或其它無血清培養(yǎng)液中加入 0.5-0.8μg DNA，混勻。
3、 使用前輕輕混勻 RNAi-Mate 試劑，切忌離心處理。用 30μl 無血清的 DMEM 或 Opti-MEM，或其他無血清培養(yǎng)基）稀釋 1-4μg RNAi-Mate 試劑（可以分別設(shè)立 DNA/RNAi-Mate 的不同用量組，通常 DNA和 RNAi-Mate 的用量在 1：2-1：5 范圍內(nèi)，針對不同的細(xì)胞需要不同的用量），輕輕混勻，室溫放置 5 分鐘。
4、 將稀釋好的 siRNA 和 RNAi-Mate 試劑混合，定容到 100μl；輕柔混勻，室溫放置 30 分鐘，以便形成 siRNA/RNAi-Mate（或 DNA/RNAi-Mate）復(fù)合物。
5、 將 100μl DNA/RNAi-Mate 復(fù)合物加到含有細(xì)胞和培養(yǎng)基的培養(yǎng)板的孔中，來回輕柔搖晃細(xì)胞培養(yǎng)板板，使 DNA/RNAi-Mate 混合物均勻覆蓋細(xì)胞。
6、 細(xì)胞在 CO2 培養(yǎng)箱中 37℃溫育 24h-48h 后，進(jìn)行轉(zhuǎn)染后的其它檢測步驟。如果細(xì)胞株比較敏感，孵育 4-6 小時(shí)后，除去復(fù)合物，更換培養(yǎng)基。
7、 如果使用可以表達(dá)綠色熒光蛋白的 DNA 載體來檢測細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，細(xì)胞轉(zhuǎn)染后 24-48 h 后，使用熒光顯微 鏡觀察計(jì)數(shù)表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞，在明場觀 察計(jì)數(shù)同一視野中的總細(xì)胞數(shù)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞率 =熒光蛋白表達(dá)細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。或使用 DAPI 等染料染核后，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。
8、 也可使用陽性對照的抑制率來標(biāo)定轉(zhuǎn)染效率。例如使用 shGAPDH 來抑制細(xì)胞內(nèi) GAPDH 基因的表達(dá)，如果轉(zhuǎn)染效率較高，shGAPDH 對 GAPDH 基因的 mRNA 和蛋白水平的抑制率通常分別為 50-90%和50-90%。反之，如果 shGAPDH 對 GAPDH 基因表現(xiàn)出較高的抑制率，也表明細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率較高，可以滿足進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)需要。
9、 如果在轉(zhuǎn)染條件摸 索實(shí)驗(yàn)中沒有找到較高 效率的轉(zhuǎn)染方法，請更換轉(zhuǎn) 染方法和試劑。如無其他方 法選擇，可以 使用流式細(xì)胞儀將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分選出來用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如果 無法分選細(xì)胞，可以在計(jì)算 RNA干擾抑制效率時(shí)去除轉(zhuǎn)染效率的影響，也可以使用抗生素對轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行初篩后再進(jìn)一步檢測抑制效率。
2??細(xì)胞的轉(zhuǎn)染
1、 設(shè)定合理的實(shí)驗(yàn)組，包括轉(zhuǎn)染試劑對照（mock transfection）、陰性對照(negative control)、陽性對照（positive control）和目的基因?qū)嶒?yàn)組。
2、 按照前面實(shí)驗(yàn)確定的細(xì)胞接種量接種。37oC 5% CO2 培養(yǎng)至 40-70%融合。
3、 按照前面實(shí)驗(yàn)確定的轉(zhuǎn)染條件轉(zhuǎn)染細(xì)胞。如果需要轉(zhuǎn)染不同培養(yǎng)量的細(xì)胞，試劑的用量可以根據(jù)本公司《RNAi 產(chǎn)品使用手冊》第 9 頁和第 13 頁所述進(jìn)行相應(yīng)的變化。
4、 轉(zhuǎn)染后 24-48h 后，收集細(xì)胞進(jìn)行下一步的檢測工作。通常，目的基因在轉(zhuǎn)染后 24-48h 內(nèi)就會(huì)表現(xiàn)出表達(dá)抑制，但有一些蛋白比如穩(wěn)定性較強(qiáng)、半衰期較長的蛋白在轉(zhuǎn)染后含量降低比較緩慢，所以需要延長檢測時(shí)間。
3??基因抑制效率的檢測
1、 在本公司的《RNAi 產(chǎn)品使用手冊》 14 頁-19 頁）中較詳細(xì)地介紹了使用熒光定量 PCR 技術(shù)和 Westernblot 方法檢測目的基因表達(dá)變化的操作步驟和注意事項(xiàng)，用戶可以酌情選用。
2、 用戶也可選用其他間接的方法（如目的基因的生物學(xué)功能或細(xì)胞生物學(xué)特性的變化）來檢測目的基因的抑制情況。鑒于這方面的檢測手段多種多樣，需要用戶自己進(jìn)行選擇，在此不再贅述?
1.Hui K, Gao Y, Huang J, Xu S, Wang B, Zeng J, Fan J, Wang X, Yue Y, Wu S, Hsieh JT, He D, Wu K. RASAL2, a RAS GTPase-activating protein, inhibits stemness and epithelial–mesenchymal transition via MAPK/SOX2 pathway in bladder cancer. Cell Death & Disease. 2017 Feb; 8(2): e2600.
2.Zhou C, Gu J, Zhang G, Dong D, Yang Q, Chen MB, Xu D. AMPK-autophagy inhibition sensitizes icaritin-induced anti-colorectal cancer cell activity. Oncotarget. 2017 Feb 28; 8(9): 14736-47. r. Cell Death & Disease. 2017 Feb; 8(2): e2600.
3.Zhang X, Liu N, Shao ZY, Qiu H, Yao H, Ji JY, Wang J, Lu W, Chen RC, Zhang L. Folate-targeted nanoparticle delivery of androgen receptor shRNA enhances the sensitivity of hormone-independent prostate cancer to radiotherapy. Nanomedicine- Nanotechnology, Biology and Medicine. 2017 May; 13(4): 1309-21.
4.Xi Z, Wang P, Xue Y, Shang C, Liu X, Ma J, Li ZQ, Li Z, Bao M, Liu Y. Overexpression of miR-29a reduces the oncogenic properties of glioblastoma stem cells by downregulating Quaking gene isoform 6. Oncotarget. 2017 Apr 11; 8(15): 24949-63. 13(4): 1309-21.
5.Wang H, Shen Q, Zhang X, Yang C, Cui S, Sun Y, Wang L, Fan X, Xu S. The long non-coding RNA XIST controls non-small cell lung cancer proliferation and invasion by modulating miR-186-5p. Cellular Physiology and Biochemistry. 2017 Apr; 41(6): 2221-9. 309-21.
6.Liu W, Mao L, Ji F, Chen F, Hao Y, Liu G. Targeted activation of AMPK by GSK621 ameliorates H2O2-induced damages in osteoblasts. Oncotarget. 2017 Feb 2; 8(6): 10543-52.?
7.Liu N, Zhang L, Wang Z, Cheng Y, Zhang P, Wang X, Wen W, Yang H, Liu H, Jin W, Zhang Y, Tu Y. MicroRNA-101 inhibits proliferation, migration and invasion of human glioblastoma by targeting SOX9. Oncotarget. 2017 Mar 21; 8(12): 19244-54.
8.Li J, Wang F, Wang G, Sun Y, Cai J, Liu X, Zhang J, Lu X, Li Y, Chen M, Chen L, Jiang C. Combination epidermal growth factor receptor variant III peptide-pulsed dendritic cell vaccine with miR-326 results in enhanced killing on EGFRvIII-positive cells. Oncotarget. 2017 Apr 18; 8(16): 26256-68.
9.Cai H, Yao J, An Y, Chen X, Chen W, Wu D, Luo B, Yang Y, Jiang Y, Sun D, He X. LncRNA HOTAIR acts as competing endogenous RNA to control the expression of Notch3 via sponging miR-613 in pancreatic cancer. Oncotarget. 2017 May 16; 8(20): 32905-17. 8.
10.Chen M, Li J, Zhuang C, Cai Z. Increased lncRNA ABHD11-AS1 represses the malignant phenotypes of bladder cancer. Oncotarget. 2017 Apr 5; 8(17): 28176-86. cer. Oncotarget. 2017 May 16; 8(20): 32905-17. 8.
11.Gao HY, Huo FC, Wang HY, Pei DS. MicroRNA-9 inhibits the gastric cancer cell proliferation by targeting TNFAIP8. Cell Proliferation. 2017 Jan 27; 50(2).?
12.He Y, Li S, Zhang W, Dai W, Cui T, Wang G, Gao T, Li C. Dysregulated autophagy increased melanocyte sensitivity to H2O2-induced oxidative stress in vitiligo. Scientific Reports. 2017; 7: 42394.
13.Li Z, Wang X, Wang W, Du J, Wei J, Zhang Y, Wang J, Hou Y. Altered long non-coding RNA expression profile in rabbit atria with atrial fibrillation: TCONS_00075467 modulates atrial electrical remodeling by sponging miR-328 to regulate CACNA1C. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 2017 Jul; 108: 73-85.?
14.Xu R, Han M, Xu Y, Zhang X, Zhang C, Zhang D, Ji J, Wei Y, Wang S, Huang B, Chen A, Zhang Q, Li W, Sun T, Wang F, Li X, Wang J. Coiled-coil domain containing 109B is a HIF1α-regulated gene critical for progression of human gliomas. Journal of Translational Medicine. 2017 Jul 8; 15(1): 165.
15.Chen X, Dong H, Liu S, Yu L, Yan D, Yao X, Sun W, Han D, Gao G. Long noncoding RNA MHENCR promotes melanoma progression via regulating miR-425/489-mediated PI3K-Akt pathway. American Journal of Translational Research. 2017; 9(1): 90-102.
目錄分類 本商品目錄中的產(chǎn)品介紹按以下內(nèi)容分類：
1. RNA干擾研究工具
2. MicroRNA研究工具?
產(chǎn)品價(jià)格 本產(chǎn)品目錄中標(biāo)示的價(jià)格均為國內(nèi)統(tǒng)一零售參考價(jià)，全部為人民幣價(jià)格。如果大量定購時(shí)，在標(biāo)準(zhǔn)價(jià)格的基礎(chǔ)上有不同程度的優(yōu)惠。?
質(zhì)量保證 凡吉瑪公司的產(chǎn)品均有嚴(yán)格的質(zhì)量保證。如果我們發(fā)現(xiàn)確實(shí)存在質(zhì)量問題時(shí)，保證更換產(chǎn)品。如果在到貨后一個(gè)月之內(nèi)用戶無提出異議，我們將視本產(chǎn)品為優(yōu)良產(chǎn)品而不再受理投訴事宜。提出產(chǎn)品異議（或投訴）時(shí)，切莫在產(chǎn)品使用完（或快使用完）后提出，以備本公司回收產(chǎn)品，確認(rèn)產(chǎn)品質(zhì)量。由于訂錯(cuò)產(chǎn)品而產(chǎn)生的退貨情況，原則上由客戶承擔(dān)相關(guān)費(fèi)用。發(fā)生投訴事宜時(shí)，公司只保證在產(chǎn)品價(jià)格額度范圍之內(nèi)酌情賠償，恕不受理超過制品價(jià)格額度以上之部分。退款時(shí)需退還原始發(fā)票。
我們保證：序列正確，符合設(shè)計(jì)原則； 質(zhì)量（偏差±10%）和純度達(dá)標(biāo)公司質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞無污染，單獨(dú)加質(zhì)粒無明顯細(xì)胞毒性（配合轉(zhuǎn)染試劑引起除外）。
shRNA載體：不保證轉(zhuǎn)染效率，不保證干擾效果。如果客戶根據(jù)有效siRNA序列，改成shRNA，存在無效風(fēng)險(xiǎn)，我們只保證序列正確，不保證干擾效果。
shRNA載體套餐：1. 不保證轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染效率良好的情況下（>80%），保證mRNA水平70%干擾效果（下限偏差不超過5%），無效可以免費(fèi)重新提供一次靶點(diǎn)（款到發(fā)貨）或退票退款或做預(yù)付款，如果重新合成款到發(fā)貨，再次無效，則不再接受投訴處理；
2. 如果是提供蛋白結(jié)果，或者是lncRNA，或者非人和鼠的其他哺乳動(dòng)物物種，只重合一次，重合還是無效也不再處理，客戶貨款正常支付。
3. cirRNA、非哺乳動(dòng)物或者其他不適合提供套餐服務(wù)的基因，不提供套餐，不保證干擾效果。
備注：
1.?以上無效需經(jīng)過公司確認(rèn)，如果驗(yàn)證符合公司出貨標(biāo)準(zhǔn)，客戶仍需支付相關(guān)費(fèi)用。
2.?所有陽性或有效性確認(rèn)，不同細(xì)胞表達(dá)調(diào)控不同，所以只需一種細(xì)胞或樣品確認(rèn)效果即可，不保證所有細(xì)胞或樣品一定符合陽性結(jié)果。
3.?所有實(shí)驗(yàn)僅供科研使用。
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