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過表達慢病毒

慢病毒表達載體，即通常所說的穿梭載體，包含了包裝、轉染、穩定整合所需要的遺傳信息。而慢病毒包裝質粒可提供所有的轉錄并包裝RNA 到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。

產品描述

慢病毒包裝系統一般由慢病毒表達載體和慢病毒包裝載體組成。?

慢病毒表達載體，即通常所說的穿梭載體，包含了包裝、轉染、穩定整合所需要的遺傳信息。而慢病毒包裝質粒可提供所有的轉錄并包裝RNA 到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為產生高滴度的病毒顆粒，需要利用表達載體和包裝質粒同時共轉染細胞，在細胞中進行病毒包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細胞外的培養基中，離心取得上清液后，可以直接用于宿主細胞的感染。?

慢病毒系統可以轉染多種細胞類型如原代細胞、干細胞、非分裂細胞等，實現可重復的穩定表達。對于一些較難轉染的細胞，慢病毒系統采用病毒包裝外源基因方式進入細胞并穩定表達，是一種理想的基因表達工具。慢病毒通過順式作用元件將病毒運送入細胞核，將所要表達的基因序列重組整合到細胞的基因組中，從而實現目的序列持續穩定的高表達。?
吉瑪公司傾情推出過表達慢病毒系列產品，為廣大科研工作者提供有力的過表達手段，解決轉染效率低的難題。?

吉瑪公司過表達慢病毒交貨期限及收費標準：

產品	規格	報價（元）	生產周期（工作日）
過表達慢病毒1（≤300bp）	10^8TU/ml	￥4880	40
過表達慢病毒2（≤300bp）	10^9TU/ml	￥5880	40
過表達慢病毒3（≤3000bp）	10^8TU/ml	基因數*2+￥3880	40-60
過表達慢病毒4（≤3000bp）	10^9TU/ml	基因數*2+￥4880	40-60

備注：慢病毒需要干冰件運輸，除江浙滬外所有地區，需要加收￥300 運費。

吉瑪公司全基因合成真核過表達載體類型：

載體名稱(編號)	目的基因啟動子	熒光標簽	真核抗性
LV4	EF-1a	GFP	--
LV5	EF-1a	CopGFP	Puro
LV6	EF-1a	--	Puro
LV7N	EF-1a	mCherry	--
LV8N	EF-1a	mCherry	Puro
LV11	CMV	--	Neo
LV11A(LV11-CMV-MCS-hPGK-GFP-Puro)	CMV	CopGFP	Puro
LV11B(LV11-CMV-MCS-hPGK-mCherry-Puro)	CMV	mCherry	Puro
LV13	EF-1a	luci05	Puro
LV14	EF-1a	luci17	--
LV17	EF-1a	luci17	Puro
LV18	CMV	--	Puro
LV18A(LV18-EF-1a-MCS-CMV-mCherry-T2A-Puro)	EF-1a	mCherry	Puro
LV18B(LV18-EF-1a-MCS-hPGK-mCherry-T2A-Puro)	EF-1a	mCherry	Puro
LV18C(LV18-CMV-T2A-Neo)	CMV	--	Neo
LV18D(CMV-MCS-hPGK-mCherry-T2A-Puro)	CMV	mCherry	Puro
LV18E(CMV-MCS-mPGK-GFP-T2A-Puro)	CMV	GFP	Puro

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注意事項：

?1、上述價格均不包括運輸費用。江浙滬地區1、上述價格均不包括運輸費用。江浙滬地區免收運費，其它城市或地區收取干冰寄送費用300元。?
2、本公司原則上只提供假病毒顆粒形式的慢病毒產品。如果客戶需要我們提供上游構建的干擾穿梭載體，則需要額外支付相應的穿梭載體購買費用（1000元/個），過表達慢病毒的穿梭載體不予提供。?
3、如客戶所需包裝的目的基因由客戶提供，則客戶應提供所要構建慢病毒的目的基因的序列及其它相關說明信息（例如裝載載體、質粒圖譜、酶切位點等）。客戶應對所提供的材料及信息負責，如因客戶提供的材料及信息不準確而引起的實驗延誤或經濟損失由客戶承擔。?
4、由于過表達慢病毒滴度有可能收到表達基因及其長度影響，如第一次包裝未達到滴度則重新包裝一次，如果仍未達到滴度則按實際滴度出貨，客戶至少需付貨款金額的50%。實驗周期相應延長；客戶基因中存在特殊序列或基因結構復雜（如：10bp以上的重復序列；8bp以上的同一堿基的連續結構；GC含量超過70%等）時需視具體情況另行協商收費標準。?
5、如客戶需委托本公司使用包裝好的慢病毒感染目的細胞，建立穩定表達目的基因或目的shRNA的細胞系，則相關實驗費用另外計算。
6、例如按照10^8TU的規格包裝滴度在10^7~10^8TU/ml,我們認為是合格的，如果低于10^7TU/ml,我們會再重新包裝一次，如果滴度依舊很低，我們會與客戶溝通協商出貨價格，最多減免1000元.但如果操作沒問題，通常不會再次反復包裝，如果不接受，可以不發貨不收款，miRNA相關病毒只保證序列、滴度達到要求，效果不同細胞不予保證。對于特殊訂單（客戶提供穿梭載體、基因較長，特殊結構，需特殊處理表達，基因對細胞正常生長有可能產生影響等），我們通常會收取50%預付款，才能安排生產，而且生產周期要有溝通，而且如果生產對照、實驗操作沒問題，實驗結果達不到預期我們預付款也是要收的。
7、由rnaisupport@genepharma.com聯系的訂單，訂單發送請同時抄送該郵箱，以免訂單遺漏溝通有誤。

元件	功能
RSV/5'LTR	Hybrid RSV promoter-R/U5 long terminal repeat; required for viral packaging and transcription
Psi pack	Packaging signal
RRE	Rev response element binds gag and involved in packaging of viral transcripts
cPPT	Central polypurine tract (includes DNA Flap region) involved in nuclear translocation and integration of transduced viral genome
EF1a promoter	RNA polymerase II promoter for expression of target gene insert
CMV promoter	Human cytomegalovirus (CMV)--constitutive promoter for transcription of reporter gene
T2A	Thosea asigna virus 2A translational cleavage site containing 18 amino acid residues. Cleavage occurs via a co-translational ribosome skipping mechanism between the C-terminal Glycin and Prolin residues, leaving 17 residues attached to the end of copGFP and 1 residue to the start of the puromycin resistance marker
Puro	Puromycin-resistant marker for selection of the ransfected/transduced cells
WPRE	Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element-- enhances the stability of the viral transcripts
3' LTR	Required for viral reverse transcription; self- inactivating 3' LTR with deletion in U3 region prevents formation of replication-competent viral particles after integration into genomic DNA
Amp	Ampicillin resistant gene for selection of the plasmid in E. coli

備注：
?1. 對于普通線性基因（mRNA/lncRNA）
? ? 轉染效率良好的情況下（>80%），保證mRNA水平上調有顯著性差異（與對照組相比）。

?2. 對于CircRNA
? ? 保證序列設計符合設計原則，保證序列合成和訂單要求一致，保證滴度和體積達到共同保證要求，不保證干擾效果。非承諾質量問題，無效也需付款。

?3. 對于Mimic病毒
? ? 保證序列正確、滴度和體積達到共同保證要求，一般工具細胞上（比如293T）qPCR能檢測到miRNA上調有顯著性差異，客戶細胞如果檢測不到過表達，可以換成前體或者初級體試一下（款到發貨）。

功能介紹與實驗實例

目前，我公司慢病毒載體是以國際通用的第三代載體系統為基礎，通過一定改建，構成四質粒體系。其中，轉移載體（transfer vector）包含轉移目的基因的慢病毒骨架及其包裝產生相應基因組RNA的所有順式作用元件，并且可以單一或多重組合的穩定或條件誘導性表達轉移基因或shRNA；另外，通過三個輔助質粒，提供病毒包裝所需的反式作用因子，同時采用“自我滅活”修飾，阻止子代病毒自我復制和轉移，從而確保產生的慢病毒具備良好的生物安全性。?
生物安全?
1、安全性?
（1）刪除了全部HIV-1的編碼基因，在介導目的基因的表達時，沒有任何HIV-1蛋白的表達；?
（2）對5’和3’ LTR分別進行了刪除改造，5’LTR缺失U3，換上RSV enhancer/promoter，使載體的復制不再依賴Tat；3’LTR刪除U3，使其不再具有啟動/增強活性，成為自滅活（self-inactivating, SIN）載體；?
（3）病毒包裝必需的3個蛋白Gag/Pol、Rev、VSV-G（代替HIV-1的Env）分別獨立放置在3個質粒上（pGag/Pol、pRev、pVSV-G），且互相之間沒有任何同源序列，大大降低了復制型慢病毒（RCL）的產生幾率；?
（4）與MuLV等逆轉錄病毒載體相比，慢病毒載體的整合更偏向于宿主細胞基因組的基因表達活躍區，激活沉默的原癌基因的幾率可能比逆轉錄病毒載體低；?
（5）慢病毒載體未發現有致腫瘤活性，全世界有4千萬人感染了HIV-1，發生的整合事件不計其數，但未出現一起致瘤事件，而MuLV等逆轉錄病毒載體有致瘤活性；?
（6）慢病毒的LTR的轉錄激活能力低于逆轉錄病毒，激活原癌基因能力也相對較低。?
2、實驗室安全措施?
慢病毒載體已經被全世界許多實驗室應用，沒有出現過任何意外，但仍具有潛在的產生復制型慢病毒（RCL）和致癌的風險，操作者在實驗中仍需要保持高度警惕。所有操作均應盡量在BSL2級生物安全柜中進行，并佩戴一次性口罩和手套，尤其要避免病毒接觸口、眼、鼻、耳、傷口等身體開放性區域，避免?生?溶膠，tip頭一定要選擇帶有濾芯的。必須高度注意被污染的尖銳物品，包括針頭、注射器、載玻片、移液管、毛細玻璃吸管和解剖刀。每次實驗后，立即清理所有接觸過病毒的器具，均應高壓消毒再進行下一步處理。顯微鏡臺、生物安全柜臺面等使用后，用70%乙醇擦拭。意外灑落的含病毒的液體，用衛生紙吸干后，用0.6%次氯酸鈉溶液浸泡被污染處1h。裝盛慢病毒載體的實驗用品，要單獨放置，標示清楚，并標注“危險品”字樣。盡量使用培養瓶，使用培養板來感染病毒，要防止意外灑落。對共用實驗室的人員進行慢病毒安全培訓或提示。?
成功案例?
病毒滴度測定：?

吉瑪基因實驗室細胞推薦Lentivirus感染參數：?

細胞系慢病毒感染參數
名稱	ATCC No.		細胞類型及來源		達到80%感染所需MOI
293T	CRL-11268		人胚胎腎細胞		1
95D	——		人高轉移肺腺癌細胞		3
CNE-1	——		人鼻咽癌細胞（高分化）		50
hADSC	——		人脂肪肝細胞		100
HEC-1B	HTB-113		人子宮內膜癌細胞		5
Hep-2	——		人喉表皮樣癌細胞		20
hFOB1.19	——		永生化人成骨細胞		2
HL-60	CCL-240		人原髓細胞白血病細胞		50
HLE-B3	——		人晶狀體上皮細胞		1
hMSC	——		人骨髓間充質干細胞		50
hSMC	——		人平滑肌細胞		50
HUVEC	——		人臍靜脈內皮細胞		5
Jurkat	TIB-152		人白血病細胞		100
MCF-7	HTB-22		人乳腺腺癌細胞		5
MDA-MB-231	HTB-26		人乳腺癌細胞		10
SaoS-2	——		人成骨肉瘤細胞		20
SGC-7901	——		人胃癌細胞		5
SHG-44	——		人膠質瘤細胞		10
SKOV-3	HTB-77		人卵巢癌細胞		5
SMMC-7721	——		人肝癌細胞		1
SPC-A-1	——		人肺腺癌細胞		10
THP-1	TIB-202		人單核細胞		100
U251	——		人膠質瘤細胞		1
U-20S	HTB-96		人骨癌細胞		5
U937	CRL-1593.2		人組織細胞淋巴瘤細胞		100
HSC-T6	——		永生化大鼠肝星型細胞		3
PC-12	CRL-1721		大鼠腎臟嗜鉻細胞		100
H9c2(2-1)	CRL-1446		大鼠心肌細胞		1
KM3	——		大鼠骨髓癌細胞（B淋巴細胞）		50
原代培養細胞慢病毒感染參數
細胞名稱		種屬	細胞類型及來源	達到80%感染所需MOI
甲狀旁腺原代細胞		人	甲狀旁腺組織	50
胚椎間骨髓核細胞		人	胚胎組織	5
血管平滑肌細胞		大鼠	血管平滑肌	>100
膠質細胞		大鼠	腦組織0	5

培養器皿	底面積（cm2）	加培養液量（mL）	可獲細胞量
96孔培養板	0.32	0.1	0.5-2.0×10^4
48孔培養板	0.8	0.2	0.2-1×10^5
24孔培養板	1.9	1.0	0.5-2×10^5
12孔培養板	3.8	2.0	1-4×10^5
6孔培養板	9.6	2.5	3-8×10^5
3.5cm培養皿	9.6	3.0	3-8×10^5
6cm培養皿	28	5.0	1-3×10^6
9cm培養皿	49	10.0	2-5×10^6
10cm培養皿	55	10.0	3-8×10^6
25cm塑料培養瓶	25	5.0	5×10^6
75cm塑料培養瓶	75	15-30	2×10^7
25cm玻璃培養瓶	19	4.0	3×10^6
100cm玻璃培養瓶	37.5	10.0	6×10^6
250cm玻璃培養瓶	78	15.0	2×10^7
2500cm旋轉培養瓶	700	100-250	2.5×10^8

使用方法

Lentivirus在細胞水平使用?
GenePharma提供的重組Lentivirus顆粒是以VSV-G膜蛋白包裹，從而大大增加了病毒感染譜，但對不同組織細胞親嗜性仍有差別，因此，有必要在使用Lentivirus顆粒之前請查閱有關文獻，了解Lentivirus對靶細胞的親嗜性、感染復數（MOI值）及體內（in vivo）注射所需的病毒量，若無相應文獻支持，則需要檢測病毒對靶細胞的親嗜性。?
1、病毒滴度復核（有限稀釋法測定）?
（1）滴度檢測前一天，對293T細胞傳代，96孔板每個孔加入約5×104cells/ml，體積50~100ul；?
（2）第二天，準備3~5個無菌EP管，在每個管中加入90ul的新鮮完全培養基（高糖DMEM+10%FBS）；?
（3）取待測定的病毒原液10ul加入到第一個管中，輕輕混勻后，取10ul加入到第二個管中，然后依次操作直到最后一管；?
（4）選取所需的細胞孔，吸棄90ul培養液，然后將稀釋好的病毒液，從低濃度到高濃度依次加入，放入37℃ 5% CO2培養箱中培養；?
（5）48小時后，每孔加入100ul新鮮培養液，小心操作，不要吹起細胞；?
（6）3~4天后，觀察熒光表達情況，正常情況下，熒光細胞數隨稀釋倍數增加而相應減少，計數最后二個含有熒光細胞的孔中的熒光細胞個數，將得到的數值除以各自相應的稀釋倍數，即可計算出病毒原液的滴度值（通常以倒數第二個孔中的讀數值更為準確）。?
注釋：?
（1）典型的病毒滴度測定結果見圖一（Fig. 1）；?
（2）病毒滴度測定結果還依賴于本身實驗系統，如293T細胞代數、細胞狀態、熒光顯微鏡品質、相關實驗試劑及實驗人員操作技能，因此不同實驗室測得滴度數值會有所差異（1~5倍），但基本不會影響正常實驗流程；?
（3）病毒滴度(BT = TU/ml, transducing units)計算公式： TU/μl = (P × N / 100 × V) ×1/DF， P = % GFP+ cells，N = 轉染時的細胞數V =每孔加入病毒稀釋液體積（μl），DF =稀釋因子（dilution factor）= 1 (undiluted)、10–1 (diluted 1/10)、 10–2 (diluted 1/100)。?
常用慢病毒滴度檢測方法比較?

名稱	原理	單位	特點	優缺點	與GFP熒光法相比
p24核心蛋白定量法	ELISA Kit 1	ng p24/ml LP/ml TU/ml（估計）	物理（顆粒）滴度	經典方法，簡單、重復性好	高估102~103倍
RNA基因組定量法	RT-qPCR	RNA/ml、? Vg/ml TU/ml（估計）	物理（核酸）滴度	精度高，但對儀器和操作要求高	高估102~104倍
GFP熒光計數法	FACS（流式細胞計數）	TU/ml	感染滴度	經典方法，簡單、重復性好	-
抗性克隆計數法	細胞克隆計數	TU/ml	感染滴度	克隆形成需約2周	低估5~10倍
Dot-blot法	RNA dot-blot	RNA/ml	物理（核酸）滴度	簡單，但屬于半定量
DNA 定量法	感染細胞后定量載體DNA	TU/ml	感染滴度	最接近真實感染滴度，但不同細胞感染效率不同

2、靶細胞感染預實驗?
（1）實驗前一天分別接種3~5×103 個靶細胞于96孔培養板每孔中，所加培養基體積為100μl ，不同種類的細胞生長速度有所差異，為保證有較好的實驗結果，進行病毒感染時細胞的融合率為40%~60%，因為Lentivirus表達時間較長，故在進行感染時細胞接種不宜過密；?
（2）感染預實驗應分為3組，每組均有三個不同梯度的MOI值（Multiply of Infection）。第一組為正常情況下感染，即在完全培養基中直接加入病毒。第二組為感染時添加5μg/ml Polybrene，Polybrene針對多數細胞可有效提高病毒感染效率（3~6倍）；?
（3）感染前為細胞換液，吸取細胞上清，按不同的分組情況加入所需的培養基90μl，每組三個孔；?
（4）準備2個無菌的EP管，在每個管中加入90ul的稀釋液，吸取10ul ~20ul的1×10^8TU/ml的病毒液（預先從-80℃取出迅速融化，而后將病毒放置于4度下進行操作），依次10倍稀釋，輕輕混勻，請勿產生氣泡，這樣既可得到三個病毒梯度：10、100及1000倍病毒稀釋液；?
（5）將三個不同梯度的病毒加到每組的三個孔中，計算可知，三個孔的MOI分別為100、10、1，如果所用的病毒滴度未達到1×10^8TU/ml，則相應增加病毒體積使得能夠得到不同的MOI；?
（6）把細胞板放回細胞培養箱孵育；?
（7）8~12hrs以后請觀察細胞狀態，如果細胞狀態與未感染組無明顯差異，表明lentivirus對細胞沒有明顯的毒性作用，請不要換液，繼續培養，24h后更換為新鮮培養基培養；?
（8）感染3~4天后，觀察熒光表達情況。對于生長遲緩代謝慢的細胞，可以適當延長觀察時間，中途可以換液，保持細胞的良好生長狀態；
（9）以上的操作是針對貼壁細胞設計的。懸浮細胞的區別主要在細胞分盤上，它不是需要提前一天分盤。操作時直接將細胞離心后懸浮在不同的培養基中，計數分盤后，即可以加入病毒；?
（10）通過首次實驗和重復實驗，確定目的細胞的感染方法和感染參數。結果參見如下實例。?
3、正式試驗?
? 通過預實驗可以幫助確定使用重組Lentivirus顆粒感染目的細胞的優化條件，如細胞接種密度，是否需要添加Polybrene，合適的MOI值等參數。正式實驗前，調整并保持細胞的良好狀態是非常重要的。有些對Polybrene敏感，這時候就不能添加Polybrene去增強感染效率。?
Lentivirus表達時間較長，但在一般代謝較旺盛的細胞（如293T，BHK21等）上，病毒感染24hrs后可以觀察到GFP（或者RFP）熒光；代謝比較緩慢的細胞（如原代培養細胞，神經干細胞，胚胎干細胞等）GFP（或者RFP）蛋白表達時間較長，感染后72-96hrs甚至更長時間才可以觀察到GFP（或者RFP）熒光。感染后的細胞可以連續培養一周，通過觀察GFP（或者RFP）的表達時間和表達強度來確定Lentivirus對目的細胞的感染情況。感染后期請根據細胞生長的情況對細胞進行及時換液和傳代，以保證細胞良好的生長狀態。?
運輸和儲存?
? ? 對于長距離運輸，應先將慢病毒載體保存在-80℃，再采用全程干冰運輸，以防滴度下降。慢病毒載體在-80℃保存6個月，滴度不會明顯下降。建議保存6~12個月以上的樣品，進行實驗前，重新測一次滴度。應盡量避免反復凍融（小于3次）。使用前從-80℃取出病毒，立即放在37℃水浴鍋中，輕輕晃動，使其盡快溶解，操作過程應置于冰盒上進行。用不完的病毒可以暫時放在4℃冰箱中，但最好盡快用完。?
常見問題及解決方案：?
?1.Q：通常在轉移載體中最大能夠插入多大的目的基因序列？ ?
? ??A:基于HIV基因骨架的原因，通常插入的目的基因序列要小于4kb，否則會影響病毒滴度甚至基因表達。?

?2.Q:Lentivirus對目的細胞的感染效率很低，如何提高病毒的感染效率？?
? ? A:一般，我們通過提高MOI值來提高病毒的轉染效率，必要時以在培養基中加入Polybrene（4~8μg/ml）來提高病毒的感染效率。同時，目的細胞良好的生長狀態是獲得正常感染效率的保證。?

?3.Q;lentiviirus感染，但是GFP熒光強度很弱，為什么？?
? ? A:中GFP熒光強度取決于病毒感染細胞的顆粒數、細胞本身的增殖狀態、細胞類型以及觀察時間等。一般來講，目的細胞感染病毒顆粒數越多，細胞本身增殖越快，GFP熒光會越強。Lentivirus屬于慢病毒，一般在增殖較快的細胞中病毒感染72~96h后，GFP基因表達才達到高峰。對于增殖較慢的細胞，GFP基因表達時間還會延長。?

?4.Q:感染病毒后，目的細胞死亡很厲害，為什么？?
? ? A:lentivirus可能對您的目的細胞有一定的毒性，請調整并降低感染的MOI值，并且在4hrs，8hrs或者12hrs后對細胞進行換液，用新鮮的完全培養液繼續培養觀察。

產品說明書

訂購須知

目錄分類本商品目錄中的產品介紹按以下內容分類：

1. RNA干擾研究工具
2. MicroRNA研究工具?

產品價格本產品目錄中標示的價格均為國內統一零售參考價，全部為人民幣價格。如果大量定購時，在標準價格的基礎上有不同程度的優惠。?

質量保證凡吉瑪公司的產品均有嚴格的質量保證。如果我們發現確實存在質量問題時，保證更換產品。如果在到貨后一個月之內用戶無提出異議，我們將視本產品為優良產品而不再受理投訴事宜。提出產品異議（或投訴）時，切莫在產品使用完（或快使用完）后提出，以備本公司回收產品，確認產品質量。由于訂錯產品而產生的退貨情況，原則上由客戶承擔相關費用。發生投訴事宜時，公司只保證在產品價格額度范圍之內酌情賠償，恕不受理超過制品價格額度以上之部分。退款時需退還原始發票。

交通運輸吉瑪公司承諾以最快捷的運送方式保證用戶及時收到訂購的產品。由總部直接發貨，如一次訂貨達1，000元可免運費；不足1，000元的訂貨，我們根據具體情況酌情收費(上海地區免運費）。我們公司產品一般采用快遞方式發貨。另外對應需要特殊運輸的產品（例如病毒產品等冷鏈運輸產品）需要收取300元的特殊運輸費用。

下單前請務必核對訂購表客戶信息和訂購內容無誤，訂單一經確認，當天即啟動生產。超過當日17：00后不能修改或者取消，如果需要取消訂單，由此產生的費用，將由客戶承擔。

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（3）次日17：00后，按該項產品金額的100%收取。

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