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慢病毒包裝服務
吉瑪公司傾情推出慢病毒系列產品，為廣大科研工作者在新的一年里提供有力的干擾手段，解決轉染效率低，抑制效率不高的難題。我們的慢病毒包裝快速（3-4周），性價比高，定制1ml滴度為10的9次方TU的病毒液只需要3880元/ml。
吉瑪公司傾情推出慢病毒系列產品，滴度最高可達10^10TU/ml，為廣大科研工作者在新的一年里提供有力的干擾手段，解決轉染效率低，抑制效率不高的難題。我們的慢病毒包裝快速（3-4周），性價比高，定制1ml滴度為10^9TU的病毒液只需要3880元/ml。
吉瑪公司可提供多種滴度的慢病毒液
| 滴度 | 規格 | 報價 | 如果由于表達基因影響正常細胞狀態，造成病毒滴度未達到要求，則按照實際包裝病毒滴度收費，低于10^8TU/ml，則免費包裝一次，并以實際最高包裝滴度發貨。 |
| 1*10^8TU/ml | 1ml | ￥2880 | |
| 1*10^9TU/ml | 1ml | ￥3880 |
吉瑪提供多種多樣的慢病毒構建服務
目前，我公司慢病毒載體是以國際通用的第三代載體系統為基礎，通過一定改建，構成四質粒體系。其中，轉移載體（transfer vector）包含轉移目的基因的慢病毒骨架及其包裝產生相應基因組RNA的所有順式作用元件，并且可以單一或多重組合的穩定或條件誘導性表達轉移基因或shRNA；另外，通過三個輔助質粒，提供病毒包裝所需的反式作用因子，同時采用“自我滅活”修飾，阻止子代病毒自我復制和轉移，從而確保產生的慢病毒具備良好的生物安全性。?
生物安全?
1、安全性?
（1）刪除了全部HIV-1的編碼基因，在介導目的基因的表達時，沒有任何HIV-1蛋白的表達；?
（2）對5’和3’ LTR分別進行了刪除改造，5’LTR缺失U3，換上RSV enhancer/promoter，使載體的復制不再依賴Tat；3’LTR刪除U3，使其不再具有啟動/增強活性，成為自滅活（self-inactivating, SIN）載體；?
（3）病毒包裝必需的3個蛋白Gag/Pol、Rev、VSV-G（代替HIV-1的Env）分別獨立放置在3個質粒上（pGag/Pol、pRev、pVSV-G），且互相之間沒有任何同源序列，大大降低了復制型慢病毒（RCL）的產生幾率；?
（4）與MuLV等逆轉錄病毒載體相比，慢病毒載體的整合更偏向于宿主細胞基因組的基因表達活躍區，激活沉默的原癌基因的幾率可能比逆轉錄病毒載體低；?
（5）慢病毒載體未發現有致腫瘤活性，全世界有4千萬人感染了HIV-1，發生的整合事件不計其數，但未出現一起致瘤事件，而MuLV等逆轉錄病毒載體有致瘤活性；?
（6）慢病毒的LTR的轉錄激活能力低于逆轉錄病毒，激活原癌基因能力也相對較低。?
2、實驗室安全措施?
慢病毒載體已經被全世界許多實驗室應用，沒有出現過任何意外，但仍具有潛在的產生復制型慢病毒（RCL）和致癌的風險，操作者在實驗中仍需要保持高度警惕。所有操作均應盡量在BSL2級生物安全柜中進行，并佩戴一次性口罩和手套，尤其要避免病毒接觸口、眼、鼻、耳、傷口等身體開放性區域，避免?生?溶膠，tip頭一定要選擇帶有濾芯的。必須高度注意被污染的尖銳物品，包括針頭、注射器、載玻片、移液管、毛細玻璃吸管和解剖刀。每次實驗后，立即清理所有接觸過病毒的器具，均應高壓消毒再進行下一步處理。顯微鏡臺、生物安全柜臺面等使用后，用70%乙醇擦拭。意外灑落的含病毒的液體，用衛生紙吸干后，用0.6%次氯酸鈉溶液浸泡被污染處1h。裝盛慢病毒載體的實驗用品，要單獨放置，標示清楚，并標注“危險品”字樣。盡量使用培養瓶，使用培養板來感染病毒，要防止意外灑落。對共用實驗室的人員進行慢病毒安全培訓或提示。?
成功案例?
病毒滴度測定：?
吉瑪基因實驗室細胞推薦Lentivirus感染參數：?
| 細胞系慢病毒感染參數 | |||||
| 名稱 | ATCC No. | 細胞類型及來源 | 達到80%感染所需MOI | ||
| 293T | CRL-11268 | 人胚胎腎細胞 | 1 | ||
| 95D | —— | 人高轉移肺腺癌細胞 | 3 | ||
| CNE-1 | —— | 人鼻咽癌細胞（高分化） | 50 | ||
| hADSC | —— | 人脂肪肝細胞 | 100 | ||
| HEC-1B | HTB-113 | 人子宮內膜癌細胞 | 5 | ||
| Hep-2 | —— | 人喉表皮樣癌細胞 | 20 | ||
| hFOB1.19 | —— | 永生化人成骨細胞 | 2 | ||
| HL-60 | CCL-240 | 人原髓細胞白血病細胞 | 50 | ||
| HLE-B3 | —— | 人晶狀體上皮細胞 | 1 | ||
| hMSC | —— | 人骨髓間充質干細胞 | 50 | ||
| hSMC | —— | 人平滑肌細胞 | 50 | ||
| HUVEC | —— | 人臍靜脈內皮細胞 | 5 | ||
| Jurkat | TIB-152 | 人白血病細胞 | 100 | ||
| MCF-7 | HTB-22 | 人乳腺腺癌細胞 | 5 | ||
| MDA-MB-231 | HTB-26 | 人乳腺癌細胞 | 10 | ||
| SaoS-2 | —— | 人成骨肉瘤細胞 | 20 | ||
| SGC-7901 | —— | 人胃癌細胞 | 5 | ||
| SHG-44 | —— | 人膠質瘤細胞 | 10 | ||
| SKOV-3 | HTB-77 | 人卵巢癌細胞 | 5 | ||
| SMMC-7721 | —— | 人肝癌細胞 | 1 | ||
| SPC-A-1 | —— | 人肺腺癌細胞 | 10 | ||
| THP-1 | TIB-202 | 人單核細胞 | 100 | ||
| U251 | —— | 人膠質瘤細胞 | 1 | ||
| U-20S | HTB-96 | 人骨癌細胞 | 5 | ||
| U937 | CRL-1593.2 | 人組織細胞淋巴瘤細胞 | 100 | ||
| HSC-T6 | —— | 永生化大鼠肝星型細胞 | 3 | ||
| PC-12 | CRL-1721 | 大鼠腎臟嗜鉻細胞 | 100 | ||
| H9c2(2-1) | CRL-1446 | 大鼠心肌細胞 | 1 | ||
| KM3 | —— | 大鼠骨髓癌細胞（B淋巴細胞） | 50 | ||
| 原代培養細胞慢病毒感染參數 | |||||
| 細胞名稱 | 種屬 | 細胞類型及來源 | 達到80%感染所需MOI | ||
| 甲狀旁腺原代細胞 | 人 | 甲狀旁腺組織 | 50 | ||
| 胚椎間骨髓核細胞 | 人 | 胚胎組織 | 5 | ||
| 血管平滑肌細胞 | 大鼠 | 血管平滑肌 | >100 | ||
| 膠質細胞 | 大鼠 | 腦組織0 | 5 | ||
| 培養器皿 | 底面積（cm2） | 加培養液量（mL） | 可獲細胞量 |
| 96孔培養板 | 0.32 | 0.1 | 0.5-2.0×10^4 |
| 48孔培養板 | 0.8 | 0.2 | 0.2-1×10^5 |
| 24孔培養板 | 1.9 | 1.0 | 0.5-2×10^5 |
| 12孔培養板 | 3.8 | 2.0 | 1-4×10^5 |
| 6孔培養板 | 9.6 | 2.5 | 3-8×10^5 |
| 3.5cm培養皿 | 9.6 | 3.0 | 3-8×10^5 |
| 6cm培養皿 | 28 | 5.0 | 1-3×10^6 |
| 9cm培養皿 | 49 | 10.0 | 2-5×10^6 |
| 10cm培養皿 | 55 | 10.0 | 3-8×10^6 |
| 25cm塑料培養瓶 | 25 | 5.0 | 5×10^6 |
| 75cm塑料培養瓶 | 75 | 15-30 | 2×10^7 |
| 25cm玻璃培養瓶 | 19 | 4.0 | 3×10^6 |
| 100cm玻璃培養瓶 | 37.5 | 10.0 | 6×10^6 |
| 250cm玻璃培養瓶 | 78 | 15.0 | 2×10^7 |
| 2500cm旋轉培養瓶 | 700 | 100-250 | 2.5×10^8 |
Lentivirus在細胞水平使用?
GenePharma提供的重組Lentivirus顆粒是以VSV-G膜蛋白包裹，從而大大增加了病毒感染譜，但對不同組織細胞親嗜性仍有差別，因此，有必要在使用Lentivirus顆粒之前請查閱有關文獻，了解Lentivirus對靶細胞的親嗜性、感染復數（MOI值）及體內（in vivo）注射所需的病毒量，若無相應文獻支持，則需要檢測病毒對靶細胞的親嗜性。?
1、病毒滴度復核（有限稀釋法測定）?
（1）滴度檢測前一天，對293T細胞傳代，96孔板每個孔加入約5×10^4cells/ml，體積50~100ul；?
（2）第二天，準備3~5個無菌EP管，在每個管中加入90ul的新鮮完全培養基（高糖DMEM+10%FBS）；?
（3）取待測定的病毒原液10ul加入到第一個管中，輕輕混勻后，取10ul加入到第二個管中，然后依次操作直到最后一管；?
（4）選取所需的細胞孔，吸棄90ul培養液，然后將稀釋好的病毒液，從低濃度到高濃度依次加入，放入37℃ 5% CO2培養箱中培養；?
（5）48小時后，每孔加入100ul新鮮培養液，小心操作，不要吹起細胞；?
（6）3~4天后，觀察熒光表達情況，正常情況下，熒光細胞數隨稀釋倍數增加而相應減少，計數最后二個含有熒光細胞的孔中的熒光細胞個數，將得到的數值除以各自相應的稀釋倍數，即可計算出病毒原液的滴度值（通常以倒數第二個孔中的讀數值更為準確）。?
注釋：?
（1）病毒滴度測定結果還依賴于本身實驗系統，如293T細胞代數、細胞狀態、熒光顯微鏡品質、相關實驗試劑及實驗人員操作技能，因此不同實驗室測得滴度數值會有所差異（1~5倍），但基本不會影響正常實驗流程；?
（2）病毒滴度(BT = TU/ml, transducing units)計算公式： TU/μl = (P × N / 100 × V) ×1/DF， P = % GFP+ cells，N = 轉染時的細胞數V =每孔加入病毒稀釋液體積（μl），DF =稀釋因子（dilution factor）= 1 (undiluted)、10–1 (diluted 1/10)、 10–2 (diluted 1/100)。?
常用慢病毒滴度檢測方法比較?
| 名稱 | 原理 | 單位 | 特點 | 優缺點 | 與GFP熒光法相比 |
| p24核心蛋白定量法 | ELISA Kit 1 |
ng p24/ml LP/ml TU/ml（估計） |
物理（顆粒）滴度 | 經典方法，簡單、重復性好 | 高估102~103倍 |
| RNA基因組定量法 | RT-qPCR |
RNA/ml、 Vg/ml TU/ml（估計） |
物理（核酸）滴度 | 精度高，但對儀器和操作要求高 | 高估102~104倍 |
| GFP熒光計數法 | FACS（流式細胞計數） | TU/ml | 感染滴度 | 經典方法，簡單、重復性好 | - |
| 抗性克隆計數法 | 細胞克隆計數 | TU/ml | 感染滴度 | 克隆形成需約2周 | 低估5~10倍 |
| Dot-blot法 | RNA dot-blot | RNA/ml | 物理（核酸）滴度 | 簡單，但屬于半定量 | |
| DNA 定量法 | 感染細胞后定量載體DNA | TU/ml | 感染滴度 | 最接近真實感染滴度，但不同細胞感染效率不同 |
2、 靶細胞感染預實驗?
（1）實驗前一天分別接種3~5×103 個靶細胞于96孔培養板每孔中，所加培養基體積為100μl ，不同種類的細胞生長速度有所差異，為保證有較好的實驗結果，進行病毒感染時細胞的融合率為40%~60%，因為Lentivirus表達時間較長，故在進行感染時細胞接種不宜過密；?
（2）感染預實驗應分為3組，每組均有三個不同梯度的MOI值（Multiply of Infection）。第一組為正常情況下感染，即在完全培養基中直接加入病毒。第二組為感染時添加5μg/ml Polybrene，Polybrene針對多數細胞可有效提高病毒感染效率（3~6倍）；?
（3）感染前為細胞換液，吸取細胞上清，按不同的分組情況加入所需的培養基90μl，每組三個孔；?
（4）準備2個無菌的EP管，在每個管中加入90ul的稀釋液，吸取10ul ~20ul的1×10^8TU/ml的病毒液（預先從-80℃取出迅速融化，而后將病毒放置于4度下進行操作），依次10倍稀釋，輕輕混勻，請勿產生氣泡，這樣既可得到三個病毒梯度：10、100及1000倍病毒稀釋液；?
（5）將三個不同梯度的病毒加到每組的三個孔中，計算可知，三個孔的MOI分別為100、10、1，如果所用的病毒滴度未達到1×10^8TU/ml，則相應增加病毒體積使得能夠得到不同的MOI；?
（6）把細胞板放回細胞培養箱孵育；?
（7）8~12hrs以后請觀察細胞狀態，如果細胞狀態與未感染組無明顯差異，表明lentivirus對細胞沒有明顯的毒性作用，請不要換液，繼續培養，24h后更換為新鮮培養基培養；?
（8）感染3~4天后，觀察熒光表達情況。對于生長遲緩代謝慢的細胞，可以適當延長觀察時間，中途可以換液，保持細胞的良好生長狀態；
（9）以上的操作是針對貼壁細胞設計的。懸浮細胞的區別主要在細胞分盤上，它不是需要提前一天分盤。操作時直接將細胞離心后懸浮在不同的培養基中，計數分盤后，即可以加入病毒；?
（10）通過首次實驗和重復實驗，確定目的細胞的感染方法和感染參數。結果參見如下實例。?
3、正式試驗?
? ?通過預實驗可以幫助確定使用重組Lentivirus顆粒感染目的細胞的優化條件，如細胞接種密度，是否需要添加Polybrene，合適的MOI值等參數。正式實驗前，調整并保持細胞的良好狀態是非常重要的。有些對Polybrene敏感，這時候就不能添加Polybrene去增強感染效率。?
Lentivirus表達時間較長，但在一般代謝較旺盛的細胞（如293T，BHK21等）上，病毒感染24hrs后可以觀察到GFP（或者RFP）熒光；代謝比較緩慢的細胞（如原代培養細胞，神經干細胞，胚胎干細胞等）GFP（或者RFP）蛋白表達時間較長，感染后72-96hrs甚至更長時間才可以觀察到GFP（或者RFP）熒光。感染后的細胞可以連續培養一周，通過觀察GFP（或者RFP）的表達時間和表達強度來確定Lentivirus對目的細胞的感染情況。感染后期請根據細胞生長的情況對細胞進行及時換液和傳代，以保證細胞良好的生長狀態。?
運輸和儲存?
? ? 對于長距離運輸，應先將慢病毒載體保存在-80℃，再采用全程干冰運輸，以防滴度下降。 慢病毒載體在-80℃保存6個月，滴度不會明顯下降。建議保存6~12個月以上的樣品，進行實驗前，重新測一次滴度。應盡量避免反復凍融（小于3次）。 使用前從-80℃取出病毒，立即放在37℃水浴鍋中，輕輕晃動，使其盡快溶解，操作過程應置于冰盒上進行。用不完的病毒可以暫時放在4℃冰箱中，但最好盡快用完。?
常見問題及解決方案：?
1.Q：通常在轉移載體中最大能夠插入多大的目的基因序列？ ?
?A:基于HIV基因骨架的原因，通常插入的目的基因序列要小于4kb，否則會影響病毒滴度甚至基因表達。?
2.Q:Lentivirus對目的細胞的感染效率很低，如何提高病毒的感染效率？?
?A:一般，我們通過提高MOI值來提高病毒的轉染效率，必要時以在培養基中加入Polybrene（4~8μg/ml）來提高病毒的感染效率。同時，目的細胞良好的生長狀態是獲得正常感染效率的保證。?
3.Q;lentiviirus感染，但是GFP熒光強度很弱，為什么？?
?A:中GFP熒光強度取決于病毒感染細胞的顆粒數、細胞本身的增殖狀態、細胞類型以及觀察時間等。一般來講，目的細胞感染病毒顆粒數越多，細胞本身增殖越快，GFP熒光會越強。Lentivirus屬于慢病毒，一般在增殖較快的細胞中病毒感染72~96h后，GFP基因表達才達到高峰。對于增殖較慢的細胞，GFP基因表達時間還會延長。?
4.Q:感染病毒后，目的細胞死亡很厲害，為什么？?
?A:lentivirus可能對您的目的細胞有一定的毒性，請調整并降低感染的MOI值，并且在4hrs，8hrs或者12hrs后對細胞進行換液，用新鮮的完全培養液繼續培養觀察。
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14.Zhang C, Zhang W, Lu Y, et al. NudC regulates actin dynamics and ciliogenesis by stabilizing cofilin 1. Cell research. 2016 Feb; 26: 239-53.
目錄分類 本商品目錄中的產品介紹按以下內容分類：
1. RNA干擾研究工具
2. MicroRNA研究工具?
產品價格 本產品目錄中標示的價格均為國內統一零售參考價，全部為人民幣價格。如果大量定購時，在標準價格的基礎上有不同程度的優惠。?
質量保證 凡吉瑪公司的產品均有嚴格的質量保證。如果我們發現確實存在質量問題時，保證更換產品。如果在到貨后一個月之內用戶無提出異議，我們將視本產品為優良產品而不再受理投訴事宜。提出產品異議（或投訴）時，切莫在產品使用完（或快使用完）后提出，以備本公司回收產品，確認產品質量。由于訂錯產品而產生的退貨情況，原則上由客戶承擔相關費用。發生投訴事宜時，公司只保證在產品價格額度范圍之內酌情賠償，恕不受理超過制品價格額度以上之部分。退款時需退還原始發票。
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