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公司產品
miRNA熒光定量PCR試劑盒
Hairpin-it miRNAs RT-PCR Quantitation Kit的特點: 高度特異，特異性的Stem-loop RT primer與miR-specific Molecular Beacon probe雙重保證，確保反應不受其前體及其他因素干擾；序列高度同源的miRNAs也可精確區分；
目前，最常用的檢測和定量miRNA的方法是northern雜交, 芯片(microarrays)以及核糖核酸酶保護分析(ribonuclease protection assays)，這些傳統方法都需要標記探針并與純化的RNA進行雜交。由于成熟的miRNAs及其前體共享一段相同的靶序列，而目前基于雜交的各種技術又無法通過分子大小將它們區分，因此很難專一性的識別成熟miRNAs，結果導致很高的前體背景信號。?
此外，基于雜交的各種技術需要標記步驟或放射性同位素，所得數據的動態分布范圍又很有限，使得miRNAs的檢測非常困難、費時且昂貴。
1 Hairpin-itTM miRNAs RT-PCR? Quatitation Assay 包括兩步
1) Stem-loop RT?
2) Real-time PCR
Stem-loop RT primer 與miRNA 分子的3’端結合，然后用逆轉錄酶將RNA逆轉錄成cDNA;
將得到RT產物與miRNA特異引物以及熒光標記的Molecular Beacon probes一起進行優化的real-time PCR反應。
2 Hairpin-itTM miRNAs RT-PCR Quantitation Kit 的特點
1) 高度特異，特異性的Stem-loop RT primer與miR-specific Molecular Beacon probe雙重保證，確保反應不受其前體及其他因素干擾；序列高度同源的miRNAs也可精確區分；
2) 超寬的定量線性范圍和高度檢測靈敏度，從幾個拷貝一直到幾萬個拷貝，定量線性范圍跨越7個數量級；
3) 樣品消耗量少，僅需1-10ng total RNA；
4) 適用的樣品范圍廣，total RNA、細胞裂解物以及純化的RNA都可以用于qRT-PCR 的模板，即使基因組DNA的污染也不會干擾miRNA的定量；
5) 金牌質量的miRNA標準合成物，即可精確用來作標準曲線絕對定量之用，又可用來作相對定量的陽性對照
6) 操作快速簡單，可實現RT與PCR反應一步完成；
7) 重復性好，經過吉瑪公司經驗豐富的技術人員嚴格的質量檢驗。
3 Hairpin-itTM?miRNAs?RT-PCR Quantitation Kit?的產品訂購信息
| Hairpin-itTM??miRNAs RT-PCR Quantitation Kit | ||
| 目錄號 | 規格 | 價格 |
| E01006 | 50?rxns | ￥600 |
| E01007 | 100 rxns | ￥1,100 |
| E01008 | 200rxns | ￥2,000 |
| E01009 | 300rxns | ￥2,500 |
| E01005 | 500 rxns | ￥3,600 |
4 Hairpin-itTM?miRNAs RT-PCR Quantitation Kit 的成分組成
ROX Reference Dye 是用以校正孔與孔之間產生的熒光信號誤差,需要使用低濃度 ROX Reference Dye 校正的儀器有Applied Biosystems 7000/7300/7500/7500 Fast/7900 Real-Time PCR System，配套ROX 終濃度1×（0.4 μl）；需要使用高濃度ROX Reference Dye 校正的 儀器有Applied Biosys-tems Step One Plus Real-Time PCR System 和QuantStudio系列，配套ROX 終濃度為5×（2 μl）。其他品牌儀器不需要ROX校準，ROX Reference Dye需要避光保存。
5 Hairpin-itTM? miRNAs?RT-PCR Quantitation Kit?的適用機型
適用的熒光定量PCR儀器ABI PRISM 7000/7300/7500/7900 MJ-opticon、Opticon2、Chromo4 及QuantStudio系列、MX3000p/4000 Bio-Rad IQ系列、Light Cycler、Rotogene3000、FTC-2000。
Hairpin-itTM miRNAs RT-PCR Quantitation Kit提供的是利用實時熒光定量PCR對總 RNA中的miRNA檢測與定量的一種方法，其不但靈敏而且極具特異性。miRNA 是由動物、植物和病毒基因組所編碼的一種短小，單鏈，約有19-23個核苷 酸組成的RNA，成熟的miRNA參與組成“RNA誘導的沉默復合體”，并且指導該 復合體進行轉錄、轉錄后翻譯的抑制或是特異性的內切靶mRNA。與一般的 miRNA檢測方法不同，該Hairpin-itTM miRNAs RT-PCR Quantitation Kit具有更快速，更靈敏的特點。
該試劑盒內有miRNA特異的逆轉錄引物，以及PCR正反向引物套裝，并且 還帶有熒光染料，莖-環結構樣的miRNA特異逆轉錄引物以及高度特異的正反向引物使得逆轉錄和PCR反應避免了miRNA前體的干擾，而反應的模板可以是 總RNA或者細胞裂解物。
該體系提供了一種最低能檢測到10個拷貝目標miRNA的高靈敏度的檢測 方法，并且具有一個寬廣的動態變化范圍，能夠實現從1μg總RNA中精確定 量檢測高拷貝數的miRNA。
高度特異性 莖環結構的逆轉錄引物以及miRNA高特異的引物套裝保證了 該方法的高度特異性，即使是高度同源的miRNA都能被準確區分。
熒光定量PCR比傳統的miRNAs定量檢測方法（如Northern blot和micro-array）具有更寬廣的動態變化范圍（至少7 次方的數量）和更高的靈敏度，保證了該方法能夠準確定量0.1pg總RNA 中，最低量至7個拷貝的目標miRNA。更總RNA、細胞裂解物或是已純化的miRNA分離物都可用于試劑盒反應所需的模板，甚至有基因組DNA的污染也不會干擾miRNA定量。
mmiRNA標準品能夠用來制作標準曲線，當您想知道一個細胞中miRNA 的絕對數量時。如果您想得到miRNA和U6snRNA或者5S rRNA之間相對表達量之比，該標準品可起陽性對照的作用。
Hairpin-itTM miRNA定量分析包括兩個步驟：莖環結構逆轉錄引物的逆轉錄反應和實時熒光定量PCR。莖環結構的逆轉錄引物能與miRNA的3’ 端的部分結合，在逆轉錄酶的作用下進行逆轉錄反應。然后特異的正反向引物和熒光染料共同參與的定量PCR反應體系，對上述逆轉錄產物進行 定量檢測。
1 用戶需要提供的材料
1) RNA 酶抑制劑(RNase inhibitor)
RNA酶抑制劑是從人胎盤中提取的一種廣譜的核糖核酸酶抑制劑，分子量
約50KDa，在cDNA合成過程中可保護RNA不被RNA酶降解，提高cDNA質
量。
2) 良好光學PCR板或PCR管
為了消除在熒光檢測的步驟中由于 PCR 管或是 PCR96 孔板所帶來的誤
差，我們推薦您使用與ABI PRISM 7000/7300/7500/7900, MX3000p/4000p 等
儀器配套的PCR管及96孔板。
2 miRNA檢測試劑盒
實驗數據：吉瑪公司的miRNA檢測試劑盒具有良好的線性動態范圍和靈敏度：
Hairpin-itTMmiRNA 實時定量分析包括兩步：莖環結構的逆轉錄反應和定量 PCR 檢測。莖環結構的逆轉錄引物能與 miRNA 分子 的 3’端結合，并在逆轉錄酶的作用下進行反應，然后在高度特異的 正反向引物和熒光染料共同參與的定量 PCR 反應體系中，對上述逆轉錄產物定量檢測。???????????
為了獲得目標miRNA相對管家基因（如U6 ?snRNA 或者 5S rRNA）的相對表達量，U6 snRNA或者 5S rRNA定量PCR校準試劑 盒是非常必要的，請參照該說明書第一頁的“相關產品”。如果您 想獲取更多信息，請登陸我們的網站：http://www.wdodo.com.cn。
為了獲得目標miRNA相對管家基因（如U6 ?snRNA 或者 5S rRNA）的相對表達量，U6 snRNA或者 5S rRNA定量PCR校準試劑 盒是非常必要的，請參照該說明書第一頁的“相關產品”。如果您 想獲取更多信息，請登陸我們的網站：http://www.wdodo.com.cn。
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miRNA 標準品的操作
吉瑪提供的 miRNA 標準品是 1pmol 干粉的貯存形式，操作該標準品的時候請參照以下的技術指導：
稀釋：把裝有 RNA 標準品的管子于 10000 轉/分鐘離心一分鐘。小心打開管蓋，加入 1ml RNA dilution buffer（由試劑 盒提供）將此 RNA 標準品干粉稀釋至 1nM，另拿一個 DEPC 處理過并滅菌過的 EP 管將 1nM 的貯存溶液稀釋至 0.1nM 作 為工作濃度。然后再用同樣處理的管子，把 0.1nM? 的標準品 稀釋液按照實驗需要稀釋成一系列的數量級（5~7 個）來制作標準曲線。
貯藏：將 1nM 的標準品溶液和 0.1nM 的工作液存放在–20
稀釋：把裝有 RNA 標準品的管子于 10000 轉/分鐘離心一分鐘。小心打開管蓋，加入 1ml RNA dilution buffer（由試劑 盒提供）將此 RNA 標準品干粉稀釋至 1nM，另拿一個 DEPC 處理過并滅菌過的 EP 管將 1nM 的貯存溶液稀釋至 0.1nM 作 為工作濃度。然后再用同樣處理的管子，把 0.1nM? 的標準品 稀釋液按照實驗需要稀釋成一系列的數量級（5~7 個）來制作標準曲線。
貯藏：將 1nM 的標準品溶液和 0.1nM 的工作液存放在–20
℃是非常重要的，如能置于–70℃中，則保存時間會更長。無 RNA 酶環境：須事先注意的是:避免儲存液被 RNA 酶 污染。
a.???? 所有的操作都推薦使用無 RNA ?酶并高壓滅菌過的移 液器及吸頭。
b.???? 操作試劑時請戴上手套。
b.???? 操作試劑時請戴上手套。
miRNA 逆轉錄引物的操作
試劑盒中提供的逆轉錄引物是 10μM 的工作溶液，請根據每次
的實際用量將其稀釋成 1μM 的 miRNA 逆轉錄引物溶液貯存于–20
℃。在一次標準的 miRNA 逆轉錄中，逆轉錄引物的終濃度為 60nM。
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逆轉錄反應體系的制備
Hairpin-itTM miRNAs 定量分析所用的模板可以是總 RNA，細胞裂解產 物或是純化后的微小 RNA。投入反應的 RNA 模板量可以根據實驗的需要 從1μg?到3μg?或者更多。除了在 42℃反應比較穩定之外，對于逆轉錄 反應及逆轉錄酶并沒有特殊的要求，我們推薦您用 20μl 逆轉錄體系。更多 的信息可以參閱你所使用的逆轉錄試劑的操作說明。
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以下表格提供了一次 20μl 標準逆轉錄反應的體系（以Promega逆轉錄產品為例，貨號：M1701）
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Component
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Final Con.
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Vol/1 rxns
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5×RT buffer
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1×
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4.00 μl
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dNTP（10 mM）
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0.375 mM
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0.75 μl
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U6 snRNA/ miRNA RT primers（1 μM）1
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60 nM
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1.20 μl
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MMLV Reverse Transcriptase（200 U/μl）
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40 U
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0.20 μl
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RNA Sample 2
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1-3 μg
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X μl
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RNase Free H2O
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To 20 μl 3
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1 可單獨或混合逆轉錄miRNAs和U6；
2 RNA 模板量可以根據實驗的需要從1 μg到3 μg或者更多。
3 除了在42℃反應比較穩定之外，對于逆轉錄反應及逆轉錄酶并沒有特殊的要求，我們推薦您
? 用20μl 逆轉錄體系。
miRNA 逆轉錄程序
標準的逆轉錄反應程序：
26℃ 40 分鐘，42℃ 40 分鐘，85℃ 10 分鐘，4℃保存。
（如客戶自行提供逆轉錄試劑，反應條件須參考試劑供貨說明書）
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?
請把所有的試劑，反應的混合液和樣品至于冰上。配置完成后，請將反應的混合液置于以 cDNA 合成的溫度進行預熱后的熱循環儀上，立即開始逆轉錄反應。逆轉錄反應 85℃ 5 分鐘結束后立即將 cDNA 產物取出， 快速置冰上冷卻，后續所有步驟都在冰上進行，不要將 cDNA 產物隨便從冰上移走。
miRNAs 實時定量 PCR 的操作程序
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miRNA 逆轉錄產物的操作?? ? ? ??
混勻cDNA并且從中吸取2 μl（20 μl體系）當作定量PCR的模板。如果逆
轉錄引物工作液是U6 snRNA和miRNA的引物混合物，cDNA產物可作為U6
snRNA和miRNA熒光定量PCR反應的共同模板。逆轉錄cDNA暫時不用，可將
其存放于-20℃，三天內可保持穩定，長期保存請凍存于-80℃。
?
a. 按照下表分別配置miRNA和U6 snRNA 兩個獨立的熒光定量反應體系；
b. 建議客戶在使用前混勻并低速離心,確保2× Real-time PCR Master Mix、50× ROX
Reference Dye、引物、模板完全溶解，所有的試劑都在管底或板孔底部。
c. 建議置于冰上進行Real Time PCR反應液的配制:
| Component | Final Con. | Vol /1 rxns |
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2× Real-time PCR Master Mix（SYBR）
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1× | 10μl |
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miRNA/U6 snRNA specific Primer set（10μM）
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0.2μM | ?0.4μM |
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cDNA
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? | 2μl |
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rTaq DNA polymerase（5 U/μl）
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1U | ??? 0.2μl |
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RNase free H2O
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? | To 20μl |
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miRNAs 實時定量 PCR 反應程序
請您在您的定量PCR儀上設定如下程序：
95℃ for 3 minutes’ hold,?
40 cycles of:
95℃, 12 seconds
62℃, 40 seconds
采集熒光信號應設在 62℃這一步。
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建立一條標準曲線
試劑盒所提供的miRNAs標準品可以被添加到您從組織或是細胞中提取的
總RNA中當作miRNA對照。如果要知道一定量的RNA樣品中miRNA具體的拷 貝數，我們推薦您可以按照以下步驟建立一條標準曲線。
1.?? 向RNA標準品中加入1ml的RNA dilution buffer到1nM的貯存濃度，準備另一個1.5mlEP管，把1nM的miRNA標準溶液稀釋成0.1nM的工作濃度。把1nM miRNA標準儲存液與引物和Master Mix分開存放于-70℃。
2.?? 將0.1nM的miRNA標準品用不含RNA酶的水稀釋5~7個數量級。
3.?? 向20μl的逆轉錄體系中分別加入上述一系列稀釋的RNA樣品2μl。注意在逆 轉錄反應中每個濃度梯度應設置2~3個復孔。
4.?? 取4μl逆轉錄產物至40μl的定量PCR體系中。注意在PCR時每個濃度梯度也 應設置2~3個復孔。
5.?? 該標準曲線中，2μl 0.1nM ?的RNA標準品加入至20μl逆轉錄體系中約代表 每個反應中包含6 ×107個拷貝。
1．如果是做多重反應，把所需的共同組分配成mix分裝于管中或板孔中，再單
1．如果是做多重反應，把所需的共同組分配成mix分裝于管中或板孔中，再單
獨加反應所需的不同組分，所有操作務必在冰上進行。在做PCR反應時必須 嚴格的配制Mix來減少移液的誤差。
2. 確保所有的試劑都在管底或板孔底部，必要的話可以短暫的離心。
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質量控制
本產品用Hela細胞總RNA作為模板，用qRT-PCR進行了嚴格的測試，動態分析必
須表明在1pg的Hela細胞總RNA中，減少靶標的濃度和GAPDH和mRNA的量具有線 性的劑量效應。
Cui, W., Q. Li, et al. "MiR-126-3p regulates progesterone receptors and involves development and lactation of mouse mammary gland." Molecular and Cellular Biochemistry 355(1): 17-25.
Zhang, C., J. Zhang, et al. "High level of miR-221/222 confers increased cell invasion and poor prognosis in glioma." Journal of Translational Medicine 10(1): 119.
Li, H. M., C. M. Wang, et al. "MiR-15a Decreases Bovine Mammary Epithelial Cell Viability and Lactation and Regulates Growth Hormone Receptor Expression." Molecules 17(10): 12037-12048.
Chen, L., L. Han, et al. "VHL regulates the effects of miR-23b on glioma survival and invasion via suppression of HIF-1/VEGF and -catenin/Tcf-4 signaling." Neuro-Oncology 14(8): 1026-1036.
目錄分類 本商品目錄中的產品介紹按以下內容分類：
1. RNA干擾研究工具
2. miRNA研究工具?
產品價格 本產品目錄中標示的價格均為國內統一零售參考價，全部為人民幣價格。如果大量定購時，在標準價格的基礎上有不同程度的優惠。?
質量保證 凡吉瑪公司的產品均有嚴格的質量保證。如果我們發現確實存在質量問題時，保證更換產品。如果在到貨后一個月之內用戶無提出異議，我們將視本產品為優良產品而不再受理投訴事宜。提出產品異議（或投訴）時，切莫在產品使用完（或快使用完）后提出，以備本公司回收產品，確認產品質量。由于訂錯產品而產生的退貨情況，原則上由客戶承擔相關費用。發生投訴事宜時，公司只保證在產品價格額度范圍之內酌情賠償，恕不受理超過制品價格額度以上之部分。退款時需退還原始發票。
下單前請務必核對訂購表客戶信息和訂購內容無誤，訂單一經確認，當天即啟動生產。 超過當日17：00后不能修改或者取消，如果需要取消訂單，由此產生的費用，將由客戶承擔。
【取消訂單費用規則】
（1）當日17：00前，免費修改或取消。
（2）當日17：00到次日17：00前，按該項產品金額的50%收取。
（3）次日17：00后，按該項產品金額的100%收取。