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公司產品

mRNA熒光定量PCR試劑盒

吉瑪提供的mRNA檢測試劑盒為客戶提供了一種便捷,準確的基因定量檢測方法,吉瑪公司為您精心設計的基因特異性引物,并且提供預優化的反應體系,檢測特異性強,擴增效率高,為您提供相關基因研究提供了強有力的工具。

產品描述

Custom Real-Time PCR?

Gene Detection Assay
目錄號
規格
價格
E021001
50 rxns
¥600
E021002
100 rxns
¥1,100
E021003
200 rxns
¥2,000
E021004
300rxns
¥2,500
E021005
500 rxns
¥3,600

?

試劑盒組成20μl?反應體系×100次)

Real-Time PCR Master Mix(2×Conc.)* 1.0 ml×1 支?
Taq DNA polymerase (5U/μl)20μl×1支?
Random N6 (100μM)500μl×1支?
RNase free H2O 1.5ml×2支?

*內含dNTP Mixture, Mg2+等。

產品特點

預先優化好的熒光定量PCR反應體系;

應用TaqMan熒光PCR基因檢測技術;

實驗操作簡便,只需加入模板和Taq 酶即可;

用本試劑盒就可完成目標基因檢測和表達定量研究;

輕松獲得基因表達實驗結果。

服務特點


您只需要提供您感興趣基因的GeneBank登錄號。

免費設計引物和探針服務。

免費優化反應體系服務。

免費實驗過程技術支持服務。

試劑盒原理
本試劑盒采用Displacement probe和TaqMan熒光PCR基因檢測技術。原理請參閱請參閱A2、A4及F2頁。

?

GAPDH Gene

Endogenous Control Kit
目錄號 規格 價格
E03002 100 rxns ¥1,000
E03003 200 rxns ¥1,600
E03004 300rxns ¥2,500
E03005 500 rxns ¥3,800


?

試劑盒組成(20μl 反應體系×100次)

Real-Time PCR Master Mix(2×Conc.)*
1.0 ml×1支Taq DNA polymerase (5U/μl) 20μl×1支GAPDH RT Primer (10μM) 20μl×1支GAPDH Primer set (10μM)
40μl×1支RNase free H2O 1.5ml×2支
*內含dNTP Mixture, Mg2+等。

產品特點
預先優化好的熒光定量PCR反應體系;
應用TaqMan熒光PCR基因檢測技術檢測樣本中GAPDH基因;
實驗操作簡便,只需加入模板和Taq 酶即可。
可直接用于以GAPDH為內參照的基因表達定量研究

適用的熒光定量PCR儀器

ABI PRISM 7000/7300/7500/7900
MJ-opticon、Opticon2及Chromo4 系列
Bio-Rad IQ系列、Light Cycler、Rotogen 3000
X3000P/4000、FTC-2000

?

β-actin Gene

Endogenous Control Kit
目錄號 規格 價格
E04002 100 rxns ¥1,000
E04003 200 rxns ¥1,600
E04004 300rxns ¥2,500
E04005 500 rxns ¥3,800

?

試劑盒組成(20μl 反應體系×100次)

Real-Time PCR Master Mix(2×Conc.)* 1.0 ml×1支Taq DNA polymerase (5U/μl) 20μl×1支β-actin RT Primer (10μM) 20μl×1支β-actin Primer set (10μM)40μl×1支RNase free H2O 1.5ml×2支
*內含內含dNTP Mixture, Mg2+等。

產品特點

預先優化好的熒光定量PCR反應體系;

應用TaqMan熒光PCR基因檢測技術檢測樣本中的β-actin基因;

實驗操作簡便,只需加入模板和Taq 酶即可。

可直接用于以β-actin為內參照的基因表達定量研究。

適用的熒光定量PCR儀器

ABI PRISM 7000/7300/7500/7900

MJ-opticon、Opticon2及Chromo4 系列

Bio-Rad IQ系列、Light Cycler、Rotogen 3000

MX3000P/4000、FTC-2000


目錄號 產品名稱 規格 價格
E05001 B2M (beta-2-microglobulin)?對照試劑盒 50 rxns ¥600
E05002 B2M (beta-2-microglobulin)?對照試劑盒 100 rxns ¥1,100
E05003 B2M (beta-2-microglobulin)?對照試劑盒 200 rxns ¥2,000
E05004 B2M (beta-2-microglobulin)?對照試劑盒 300 rxns ¥2,500
E06001 GUSB (beta glucuronidase)?對照試劑盒 50 rxns ¥600
E06002 GUSB (beta glucuronidase)?對照試劑盒 100 rxns ¥1,100
E06003 GUSB (beta glucuronidase)?對照試劑盒 200 rxns ¥2,000
E06004 GUSB (beta glucuronidase)?對照試劑盒 300 rxns ¥2,500
E07001 HPRT1 (HGPRT)?對照試劑盒 50 rxns ¥600
E07002 HPRT1 (HGPRT)?對照試劑盒 100 rxns ¥1,100
E07003 HPRT1 (HGPRT)?對照試劑盒 200 rxns ¥2,000
E07004 HPRT1 (HGPRT)?對照試劑盒 300 rxns ¥2,500
E08001 PGK1(phosphoglycerate kinase 1)?對照試劑盒 50 rxns ¥600
E08002 PGK1(phosphoglycerate kinase 1)?對照試劑盒 100 rxns ¥1,100
E08003 PGK1(phosphoglycerate kinase 1)?對照試劑盒 200 rxns ¥2,000
E08004 PGK1(phosphoglycerate kinase 1)?對照試劑盒 300 rxns ¥2,500
E09001 PPIA(cyclophilin)?對照試劑盒 50 rxns ¥600
E09002 PPIA(cyclophilin)?對照試劑盒 100 rxns ¥1,100
E09003 PPIA(cyclophilin)?對照試劑盒 200 rxns ¥2,000
E09004 PPIA(cyclophilin)?對照試劑盒 300 rxns ¥2,500
E10001 RPLP0(large ribosomal protein)?對照試劑盒 50 rxns ¥600
E10002 RPLP0(large ribosomal protein)?對照試劑盒 100 rxns

¥1,100

E10003 RPLP0(large ribosomal protein)?對照試劑盒 200 rxns ¥2,000
E10004 RPLP0(large ribosomal protein)?對照試劑盒 300 rxns ¥2,500
E11001 TBP(TATA-box binding protein)?對照試劑盒 50 rxns ¥600
E11002 TBP(TATA-box binding protein)?對照試劑盒 100 rxns ¥1,100
E11003 TBP(TATA-box binding protein)?對照試劑盒 200 rxns ¥2,000
E11004 TBP(TATA-box binding protein)?對照試劑盒 300 rxns ¥2,500
E12001 TFRC(CD71)(transferrin receptor)?對照試劑盒 50 rxns ¥600
E12002 TFRC(CD71)(transferrin receptor)?對照試劑盒 100 rxns ¥1,100
E12003 TFRC(CD71)(transferrin receptor)?對照試劑盒 200 rxns ¥2,000
E12004 TFRC(CD71)(transferrin receptor)?對照試劑盒

300 rxns

¥2,500
E13001 Mouse ACTB(actin, beta)?對照試劑盒 50 rxns ¥600
E13002 Mouse ACTB(actin, beta)?對照試劑盒 100 rxns ¥1,100
E13003 Mouse ACTB(actin, beta)?對照試劑盒 200 rxns ¥2,000
E13004 Mouse ACTB(actin, beta)?對照試劑盒 300 rxns ¥2,500
E14001 Mouse GAPDH 對照試劑盒 50 rxns ¥6000
E14002 Mouse GAPDH?對照試劑盒 100 rxns ¥1,100
E14003 Mouse GAPDH?對照試劑盒 200 rxns ¥2,000
E14004 Mouse GAPDH?對照試劑盒 300 rxns ¥2,500
E15001 Rat ACTB(actin, beta)?對照試劑盒 50 rxns ¥600
E15002 Rat ACTB(actin, beta)?對照試劑盒 100 rxns ¥1,100
E15003 Rat ACTB(actin, beta)?對照試劑盒 200 rxns ¥2,000
E15004 Rat ACTB(actin, beta)?對照試劑盒 300 rxns ¥2,500
E16001 Rat GAPDH?對照試劑盒 50 rxns ¥600
E16002 Rat GAPDH?對照試劑盒 100 rxns ¥1,100
E16003 Rat GAPDH?對照試劑盒 200 rxns ¥2,000
E16004 Rat GAPDH?對照試劑盒 300 rxns ¥2,500

?其他基因表達及管家基因內參照試劑盒定制流程

*注:如客戶不以來電或Email形式確認地址、電話等相關聯系信息,GenePharma將視此次定制申請為無效申請。

吉瑪提供的mRNA檢測試劑盒為客戶提供了一種便捷,準確的基因定量檢測方法,吉瑪公司為您精心設計的基因特異性引物,并且提供預優化的反應體系,檢測特異性強,擴增效率高,為您提供相關基因研究提供了強有力的工具。


試劑盒組成(20μl 反應體系×100次)

Real-Time PCR Master Mix(2×Conc.)* 1ml×1支Taq DNA polymerase (5U/μl) 20μl×1支 RNase free H2O 1.5ml×2支
*內含內含dNTP Mixture, Mg2+等。

試劑保存

-20℃保存,避免反復凍融。保質期3個月。


產品特點

1、預先優化好的熒光定量PCR反應體系;

2、經實驗室驗證,適用于多種類型的熒光探針和染料;

3、適用于多種不同體積反應體系。

4、使用方便,只需加入酶、模板、探針/染料即可進行定量PCR反應.

適用的熒光定量PCR儀器


1、ABI PRISM 7000/7300/7500/7900

2、MJ-opticon、Opticon2及Chromo4 系列

3、Bio-Rad IQ系列、Light Cycler、Rotogen 3000

4、MX3000P/4000、FTC-2000

使用方法
Real-time PCR Master Mix的濃度為2×,使用時按5μl/10μl反應體系加入;在加入酶、模板、探針/染料后用水補足至所需體積后即可進行Real-time PCR反應


產品說明

Ezol?試劑是用于總RNA 抽提的試劑,適用于人類、動物、植物、細菌等組織或細胞的總RNA提取。樣本經?Ezol?充分裂解后加入氯仿離心,形成上清層、中間層和有機層, 收集上清層用異丙醇沉淀RNA。Ezol試劑操作簡便易行,可以同時處理多個樣品,并得到高質量的RNA 。純化的RNA可以直接用于RNA 印跡分析、斑點雜交、poly(A)+ 選擇、體外翻譯、RNA 酶保護分析、RT-PCR 分析、構建 cDNA 文庫等 RNA 研究。

□產品特點

1、可獲得高純度、高產率的 RNA。

2、適用于多種細胞或組織總RNA的提取

3、無論是小量的細胞(5×106)或組織(50-100mg)還是大量的細胞(107)或組織(>1g)都可得到出色的結果。

4、操作簡便,可實現RNA的快速抽提。

試劑保存

室溫或2-8℃避光保存,保質期12個月。

PROTOCOL

20毫克組織或106-107個細胞/ml?Ezol?

混勻后室溫擱置15min

按200ul氯仿/ml?Ezol加入氯仿,振蕩混勻,冰上放置10分鐘?

4℃ 12,000 rpm 15min

取上層水相移入0.5 ml EP 管內,加入等體積預冷的異丙醇?

顛倒混勻,室溫擱置10~15分鐘

4℃ 12,000 rpm 10min,

輕倒上清,吸水紙上沾干,?按1ml乙醇/ml抽提液加入75%冰乙醇輕旋顛倒洗滌?

4℃ 12,000 rpm 5min 輕倒上清,吸水紙上倒扣沾干,適度干燥?

DEPC H2O或TE溶液溶解RNA 28S RNA 18S RNA



圖 RNA電泳圖
Trouble Shooting of Ezol Total RNA Extraction Reagent

問題

可能原因

解決方法

抽提的RNA有降解

動植物體組織取下后未立即進行抽提或冰凍保存

采用新鮮組織,在研磨過程中不斷加入液氮保持組織的生物活性

溶液、試管等用具有RNase 污染

所有與RNA 抽取相關的器具均須做RNase 去除處理

抽提過程中沒有戴手套或者沒有勤換手套;抽提過程中未注意避免說話,造成唾沫中RNA 酶污染

操作過程中要佩戴手套和口罩

RNA 存放的溫度較高

RNA長期儲存請置于-80℃冰箱

RNA得率?
較低

樣品勻漿或裂解不完全

適當延長裂解時間,使樣品充分裂解

RNA 未完全溶解

避免過度干燥并延長RNA溶解時間

未選用RNA 含量豐富的新生、生長旺盛的組織或細胞

選擇較新鮮的,生長旺盛的樣品

離心機轉速和離心力不能達到要求

加大轉速或延長離心時間

抽提的RNA有DNA 污染

樣品勻漿后加入的Ezol量過少

在建議用量基礎上減少組織量或加大Ezol使用量,或用DNase I處理

將中間層吸入

吸取上清時盡量小心操作

加入氯仿前,樣本沒有在室溫下放置15分鐘;

保證樣品充分裂解;在環境溫度較低的情況下,可適度延長放置時間

加入氯仿后,振蕩過于劇烈

輕柔振蕩

樣品量過多

在建議用量基礎上減少組織量或加大Ezol?使用量,或用DNase I處理

OD260/OD280比率偏低(<1.65)

在分光光度計測量前用不適當的溶液稀釋RNA樣品,低離子強度和低pH溶液會增加280 nm的光吸收值

采用TE 或Tris-HCl溶解樣品,檢測OD 值

勻漿后樣品所加的Ezol用量偏少

在建議用量基礎上減少組織量或加大Ezol?使用量




功能介紹與實驗實例


結果







結論
電泳結果顯示產物大小正確,無雜帶說明無非特異性擴增;
電泳結果的陰性對照顯示沒有目的帶,說體系沒有污染。

相對定量計算釋
 
樣品
內參基因
目標基因
重復1
8.59
22.35
重復2
8.85
22.50
重復3
9.10
22.58
平均 CT
8.85±0.26
22.48±0.12
DCT
13.63±0.28
 
1.  “平均 CT” 表示三個重復Ct的平均值 , “±”后面的數字表示三個重復Ct的標準偏差standard deviation (SD) ,SD計算公式如下
 
2.       DCT 表示同一個樣品目標基因和內參基因平均Ct值的差值,計算如下:
microRNA/gene DCT=目標平均CT- 內參平均 CT=22.48-8.85=13.63
 
3.       DDCT 表示特定目標基因的待檢樣品和校準樣品DCt的差值 樣品and test 樣品,計算如下:
 
 
待檢 樣品
校準 樣品
內參基因
目標基因
內參基因
目標基因
重復1
8.59
22.35
8.50
21.92
重復2
8.85
22.50
8.72
22.09
重復3
9.10
22.58
9.00
22.37
Mean CT
8.85±0.26
22.48±0.12
8.74±0.25
22.13±0.23
DCT
13.63±0.28
13.39±0.34
DDCT
0.24±0.44
0.00±0.48
2-DDCT
0.85(0.62~1.15)
1.00(0.72~1.39)
 
注意: DDCT計算時, “±”后面的數值 of 我們定義為 S4,S4=Sqr(S32+S02).在此公式中”S3表示待檢樣品 DCT 的SD值, “S0表示校準樣品 DCT 的SD值.
 
 
4.       最后, 2-DDCT 和括號里的數值都來源于DDCT 值,紅色標記表示相對校準樣品表達量低,相反藍色標記表示相對校準表達量高。


使用方法

【試劑盒簡介】
mRNA基因檢測試劑盒是一款基于熒光定量PCR平臺所開發,用于特異檢測mRNA基因表達水平的試劑盒。

原理】 
Sybr Green I 是一種與雙鏈DNA小溝結合的熒光染料,Sybr Green I只與雙鏈DNA結合才能發出熒光,而不摻入鏈中的Sybr染料分子不會發射任何熒光信號,熒光信號與雙鏈DNA分子數成正比,隨著擴增產物增加而增加,熒光信號的強度代表了反應體系中雙鏈DNA分子的數量。以Sybr Green I作為檢測信號的熒光定量PCR方法稱為染料法。 
mRNA定量分析包括兩個步驟:特異性或隨機引物N6的逆轉錄反應和實時熒光定量PCR。對于逆轉錄反應這一過程而言,當特定mRNA由于含有使反轉錄酶終止的序列而難于拷貝其全長序列時,可采用隨機六聚體引物這一不特異的引物來拷貝全長mRNA。用此種方法時,體系中所有RNA分子全部充當了cDNA第一鏈模板。而特異性引物是目標RNA的互補序列,第一條鏈的合成可由與mRNA 3’端最靠近的配對引物起始,用特異性引物僅產生所需要的cDNA,使后續的PCR擴增更為特異。吉瑪采用特異性引物來進行逆轉錄反應。 


熒光定量PCR分析

1) 引物設計 

2)儀器與設備
實時熒光定量通用試劑(Cat# GMRS-001吉瑪, 上海)
FTC3000 實時熒光定量PCR儀 (楓嶺)

a.總RNA提取 
1.  將細胞用預冷PBS緩沖液洗2遍,加1ml Ezol 裂解液重懸。
2.  加入0.2ml三氯甲烷,劇烈搖動10s,室溫放置3分鐘。
3.  4℃,12,000 x g離心20min。
4.  將上清水相轉移至另一新的無RNA酶離心管中,并加入等體積的100%乙醇。
5.  吸取全部樣品,加入帶有2ml收集管的mini-spin離心柱。8,000 x g,室溫離心15 s,棄盡流穿液。
6.  將剩余的樣品轉移至離心柱,重復第6步。
7.  往離心柱中加入700μl WB,輕蓋蓋子, 8,000 x g,室溫離心15 s,棄盡流穿液。
8.  重復第8步,用500μl WB洗滌離心柱三次。
9. 將離心柱轉移至一新的無RNA酶的1.5ml離心管中,往硅膠膜中央滴加50μl DEPC水,4℃,10,000 x g離心3min洗脫RNA。


實驗體系】 

b.mRNA 逆轉錄反應體系

*注意:使用前請將RT Primer稀釋成1μM。

Component

Final Con.

Vol/rxn

RNA 模板

1-3μg

2μl

Random N6(100μM)/ Gene Specific RT Primer(1μM

25μM/60nM

5μl/1.2μl


70℃ 5min 加入下述反應體系


Component

Final Con.

Vol/rxn

5×RT buffer

4μl

dNTP(10mM)

0.375mM

0.75μl

MMLV Reverse Transctiptase (200U/μl)

0.5 U/μl

0.25μl


RNase Free H2O


To 13μl / 16.8μl

42℃,45min; 85℃,5min; 4℃保存。

*注意:如果需要在同一管體系內同時檢測目的基因和內參基因,則只需加入相同終濃度的內參基因RT引物量,把多余的水的體積扣除即可。PCR反應時必須分管做。


c.mRNA 實時熒光定量反應體系


Component

Final Con.

Vol/rxn

2× Real-time PCR Master Mix

10μl

Gene specific Primer set (10uM)

0.2μM

0.4μl

ROX referrence (50×)

1×/5×

0.4μl/2μl

cDNA 

2μl

Taq DNA ploymerase (5U/μl)

1U

0.2μl

RNase Free H2O


To 20μl


d.定量PCR反應程序

反應程序:

95℃ 3min;40cycles of 95℃ 12s, 62℃ 40s;

62℃時采集信號,選擇SYBR Green或者FAM通道。



產品說明書

相關文獻

1.Zhou Z, Wan J, Hou X, Geng J, Li X, Bai X. MicroRNA-27a promotes podocyte injury via PPARγ-mediated β-catenin activation in diabetic nephropathy. Cell death & disease. 2017 Mar; 8(3): e2658.?

2.Zhong C, Feng J, Lin X, Bao Q. continuous release of bone morphogenetic protein-2 through nano-graphene oxide-based delivery influences the activation of the NF-κB signal transduction pathway. International Journal of Nanomedicine. 2017 Feb; 12: 1215-26.

3.Xu W, Zhang Z, Zou K, Cheng Y, Yang M, Chen H, Wang H, Zhao J, Chen P, He L, Chen X, Geng L, Gong S. MiR-1 suppresses tumor cell proliferation in colorectal cancer by inhibition of Smad3-mediated tumor glycolysis. Cell Death & Disease. 2017 May; 8(5): e2761.?

4.Xiong Y, Shi L, Wang L, Zhou Z, Wang C, Lin Y, Luo D, Qiu J, Chen D. Activation of sirtuin 1 by catalpol-induced down-regulation of microRNA-132 attenuates endoplasmic reticulum stress in colitis. Pharmacological Research. 2017 Sep; 123: 73-82.

5.Chen YF, Wang SY, Yang YH, Zheng J, Liu T, Wang L. Targeting HSF1 leads to an antitumor effect in human epithelial ovarian cancer. International Journal of Molecular Medicine. 2017 Jun; 39(6): 1564-70.?

6.Chu M, Zhao Y, Feng Y, Zhang H, Liu J, Cheng M, Li L, Shen W, Cao H, Li Q, Min L. MicroRNA-126 participates in lipid metabolism in mammary epithelial cells. Molecular and Cellular Endocrinology. 2017 Oct 15; 454: 77-86.

7.Zhang B, Li H, Yin C, Sun X, Zheng S, Zhang C, Shi L, Liu Y, Lu S. Dock1 promotes the mesenchymal transition of glioma and is modulated by MiR‐31. Neuropathology and Applied Neurobiology. 2017 Apr; 43(5): 419-32.?

8.Lin G, Liu B, Meng Z, Liu Y, Li X, Wu X, Zhou Q, Xu K. MiR-26a enhances invasive capacity by suppressing GSK3β in human lung cancer cells. Experimental Cell Research. 2017 Mar 15; 352(2): 364-74.?

9.Zhao K, Wang L, Li T, Zhu M, Zhang C, Chen L, Zhao P, Zhou H, Yu S, Yang X. The role of miR-451 in the switching between proliferation and migration in malignant glioma cells: AMPK signaling, mTOR modulation and Rac1 activation required. International Journal of Oncology. 2017 Jun; 50(6): 1989-99.?

10.Ding Y, Zhang C, Zhang J, Zhang N, Li T, Fang J, Zhang Y, Zou F, Tao Z, Tang S, Zhu W, Chen H, Sun X. miR-145 inhibits proliferation and migration of breast cancer cells by directly or indirectly regulating TGF-β1 expression. International Journal of Oncology. 2017 May; 50(5): 1701-10.?

訂購須知

目錄分類 本商品目錄中的產品介紹按以下內容分類:

1. RNA干擾研究工具
2. MicroRNA研究工具?

產品價格 本產品目錄中標示的價格均為國內統一零售參考價,全部為人民幣價格。如果大量定購時,在標準價格的基礎上有不同程度的優惠。?

質量保證 凡上海吉瑪制藥技術有限公司的產品均有嚴格的質量保證。如果我們發現確實存在質量問題時,保證更換產品。如果在到貨后一個月之內用戶無提出異議,我們將視本產品為優良產品而不再受理投訴事宜。提出產品異議(或投訴)時,切莫在產品使用完(或快使用完)后提出,以備本公司回收產品,確認產品質量。由于訂錯產品而產生的退貨情況,原則上由客戶承擔相關費用。發生投訴事宜時,公司只保證在產品價格額度范圍之內酌情賠償,恕不受理超過制品價格額度以上之部分。退款時需退還原始發票。

針對circRNA檢測qPCR引物,鑒于不同細胞,不同circ序列等表達豐度有差異,有的甚至非常低或序列本身不是很確切,所以我們針對目的基因設計3對引物驗證。如果客戶檢測無效且已付款,我們可以免費重新設計3對驗證一次。如果再次無效則不再免費重做。目前我們成功率大約在80%左右(根據擴增產物大小電泳或熔解曲線判斷,如需進步對擴增產物測序鑒定費用另計:一對引物一個樣品驗證費用1500元,預付50%啟動實驗,無效只收預付款)。

對于circRNA產品線,目前不保證100%一定成功。



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