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公司產(chǎn)品
熒光探針合成
吉瑪擁有處于國(guó)際領(lǐng)先水平的siRNA化學(xué)合成、定量PCR熒光探針合成及多種核苷酸化學(xué)修飾的全部核心技術(shù)，公司的技術(shù)隊(duì)伍以在國(guó)外留學(xué)和工作多年的資深學(xué)者領(lǐng)銜，由多位在該技術(shù)領(lǐng)域具有豐富經(jīng)驗(yàn)的博士和碩士組成。
熒光探針合成(Fluorescence Labeled Probe Oligos)
吉瑪擁有處于國(guó)際領(lǐng)先水平的siRNA化學(xué)合成、定量PCR熒光探針合成及多種核苷酸化學(xué)修飾的全部核心技術(shù)，公司的技術(shù)隊(duì)伍以在國(guó)外留學(xué)和工作多年的資深學(xué)者領(lǐng)銜，由多位在該技術(shù)領(lǐng)域具有豐富經(jīng)驗(yàn)的博士和碩士組成。
質(zhì)量管理：我們所有的寡核苷酸都經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的合成監(jiān)控與質(zhì)量檢測(cè)，長(zhǎng)度與標(biāo)記由PAGE+HPLC來(lái)分析確認(rèn)品質(zhì)，確保無(wú)污染或部分標(biāo)記或無(wú)標(biāo)記探針的存在。
純度及長(zhǎng)度：可根據(jù)要求進(jìn)行除HPLC及PAGE之外的其它純化，長(zhǎng)度7－40 mers 。
產(chǎn)品形式：產(chǎn)品以干粉形式貯運(yùn)。
技術(shù)資料：包括合成的序列、純化方式、Epsilon消光系數(shù)值、oligo的分子量、數(shù)量（OD量及nmol數(shù)）
市面上常用的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)相匹配的探針組合
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淬滅基團(tuán)種類 |
熒光報(bào)告基團(tuán)種類 |
| DABCYL | 6-FAM，TET，JOE，HEX，Cy3等 |
| TAMRA | 6-FAM，TET，JOE，HEX等 |
| BHQ1 | 6-FAM，TET，JOE，HEX，Cy3等 |
| BHQ2 | TAMRA，Cy3，ROX，Texas Red等 |
| BHQ3 | Cy5，Cy5.5等 |
| Dye | Absorption wavelength | Emission wavelength | Colour |
| FAM | 495 | 520 | Green/yellow |
| TET | 525 | 550 | Orange/yellow |
| HEX | 535 | 565 | Pink |
| Quasar 570(cy3) | 550 | 570 | Dark pink |
| TAMRA | 550 | 575 | Red |
| ROX | 580 | 605 | Purple |
| CAL Fluor Red 610 | 590 | 610 | Orange /red |
| Quasar 670(cy5) | 650 | 670 | Blue |
經(jīng)多年努力實(shí)踐，本公司掌握了從上游探針原料把控到下游探針產(chǎn)品合成等一系列成熟質(zhì)量方案，所生產(chǎn)的探針產(chǎn)品基本上能夠滿足客戶要求，本公司產(chǎn)品詳情具體請(qǐng)見下圖各種探針修飾的搭配信息：
MGB原料為本公司新開發(fā)的新品，MGB探針的淬滅基團(tuán)采用非熒光淬滅基團(tuán)(Non-Fluorescent Quencher) 本身不產(chǎn)生熒光，可以大大降低本底信號(hào)的強(qiáng)度。為了獲得同樣的Tm值，MGB探針可以比普通TaqMan探針設(shè)計(jì)得更短， 既降低了合成成本，也使得探針設(shè)計(jì)的成功率大為提高，因?yàn)?/span>探針上接有MGB (Minor Groove Binder)修飾基團(tuán)，可以將探針的Tm值提高5-10°C左右.
5'熒光報(bào)告基團(tuán)
3'淬滅基團(tuán)
5'熒光報(bào)告基團(tuán)
3'淬滅基團(tuán)
5'-FAM
3'-Dabcyl
5'-CY3
3'-BHQ-l
3'-BHQ-l
3'-BHQ-2
3'-TAMRA
5'-TAMRA
3'-BHQ-l
5'-HEX
3'-Dabcyl
3'-BHQ-2
3'-BHQ-l
5'-FAM
3'-MGB
3'-TAMRA
5'-HEX
3'-BHQ-2
5'-TET
5'-TET
3'-Dabcyl
CAL
Fluor Red 610
3'-BHQ-2
3'-BHQ-l
3'-TAMRA
3'-TAMRA
3'-BHQ-2
5'-CY5
3'-BHQ-2
免費(fèi)贈(zèng)送引物
TaqMan 探針是一探針，它設(shè)計(jì)與目標(biāo)序列上游引物和下游引物之間的序列配對(duì)。PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。?
吉瑪公司Taqman探針標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，擁有良好的線性范圍和靈敏度。 ? ? ? ? ? ? ? ? ??
Q-1 TaqMan探針的工作原理是什么？
? ? ? TaqMan 探針是一種寡核苷酸探針，熒光基團(tuán)連接在探針的5’端，而淬滅基團(tuán)則在3’末端。當(dāng)探針與靶序列配對(duì)時(shí)，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與3’端的淬滅基團(tuán)接近而被淬滅。在進(jìn)行延伸反應(yīng)時(shí)，聚合酶的5’外切酶活性將探針切斷，使得熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，發(fā)射熒光。一分子的產(chǎn)物生成就伴隨著一分子的熒光信號(hào)的產(chǎn)生。隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加，釋放出來(lái)的熒光基團(tuán)不斷積累。因此TaqMan探針檢測(cè)的是積累熒光。
?
Q-2 TaqMan探針設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)該遵循哪些原則？
1．?dāng)U增長(zhǎng)度不應(yīng)超過(guò)400bp，最好控制在70-150bp內(nèi)，擴(kuò)增片段越短，越容易獲得有效的擴(kuò)增產(chǎn)物；
2. 探針應(yīng)位于兩引物之間，探針的Tm值要比引物的Tm值高8-10℃，應(yīng)在68-70℃之間；
3．探針?biāo)x序列應(yīng)該高度特異，盡量選擇具有最小二級(jí)結(jié)構(gòu)的擴(kuò)增片段；
4．探針中堿基G、C的含量應(yīng)在20％～80％之間
5．避免同種堿基成串出現(xiàn)，
6．堿基G不要出現(xiàn)在5’末端；
7．探針中堿基C的數(shù)量應(yīng)多于堿基G，否則用其互補(bǔ)的序列；
?
?
?
Q-3 探針標(biāo)記的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)應(yīng)該如何選擇？
? ? ? 當(dāng)TaqMan探針完整時(shí)，5′端 的熒光物質(zhì)受到 3′端的淬滅物質(zhì)的制約，不能檢出熒光，所以探針的報(bào)告基團(tuán)的發(fā)射波長(zhǎng)要在淬滅基團(tuán)的吸收波長(zhǎng)范圍內(nèi)。?
| 淬滅基團(tuán)種類 | 淬滅基團(tuán)性質(zhì) | 使用的報(bào)告基團(tuán)種類 | |
| TAMRA | 熒光物質(zhì) | FAM,HEX,TET,JOE 等 | |
| ECLIPSE | 非熒光物質(zhì) | FAM,HEX,TET,JOE,TAMRA,ROX 等 | |
| BHQ系列染料 | BHQ0 | 非熒光物質(zhì) | BODIPY493/503,BODIPY FL 等 |
| BHQ1 | FAM,HEX,TET,JOE 等 | ||
| BHQ2 | CY3,TAMRA,ROX,Texas Red,CY5 等 | ||
| BHQ3 | CY5 等 | ||
Q-4 合成的探針應(yīng)該如何定量？
? ? ? 由于核酸在260nm附近有此強(qiáng)吸收，因此常根據(jù)性質(zhì)，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定探針溶液在260nm的吸光度值，用OD值來(lái)表示。1OD是指：置于光路長(zhǎng)度為1cm的比色皿中的DNA\RNA的量為1OD。
?
Q-5 合成的探針應(yīng)該如何保存？
?1. 熒光探針必須避光保存。
?2. 吉瑪提供數(shù)管已分裝的干品便于客戶貯存，干品可于-80℃保存半年以上，如無(wú)條件，請(qǐng)于-20℃保存。
?3. 強(qiáng)烈建議用RNase-free的TE(pH8.0)buffer溶解探針，這樣得到的探針溶液更穩(wěn)定，保存時(shí)間更長(zhǎng)。因?yàn)榧斕峁┓盅b好的干品以避免探針溶液反復(fù)凍融，客戶可直接將探針配置成工作液(10μmol/L或20μmol/L)，同時(shí)分裝成幾分，暫時(shí)不用部分于-20℃保存。
?
?
Q-6 TaqMan探針的實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)選擇什么條件？
用TaqMan探針進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR需要優(yōu)化的條件為?【預(yù)變性】 95℃ 30 秒?
通常預(yù)變性時(shí)間為 30 秒，環(huán)狀質(zhì)粒和基因組DNA 等難變性的模板可以延長(zhǎng)至 1～2 分鐘，但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)酶容易失活，不推薦使用 2 分鐘以上的條件。?
【兩步法 PCR】?
| 變性 | 95℃ | 3～5 秒 | Real Time PCR 擴(kuò)增片段通常在 300 bp 以下，只需要 95℃、3～5 秒的變性設(shè)置。 |
| 退火/延伸 | 56～64℃ | 20～30 秒 | 首先采用 60℃、20 秒的條件設(shè)定，反應(yīng)溫度可在 56～64℃范圍內(nèi)進(jìn)行調(diào)整。反應(yīng)性能較差時(shí)，可以適當(dāng)增加這一步的反應(yīng)時(shí)間。 |
Q-7 TaqMan探針的實(shí)時(shí)定量PCR體系應(yīng)該如何優(yōu)化？
?用雜交探針進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR需要優(yōu)化的條件為：?
1）MgCl2的濃度：在4-8mM之間進(jìn)行選擇。?
2）雜交探針的濃度：初實(shí)驗(yàn)用0.2uM，如果熒光信號(hào)強(qiáng)度不足，可以增加至0.4uM。?
3）模板濃度設(shè)置：優(yōu)化的擴(kuò)增須進(jìn)行一系列稀釋度的實(shí)驗(yàn)，在條件有困難的情況下，至少要進(jìn)行兩個(gè)稀釋度的測(cè)定。選用1pg-1ug的總RNA或是mRNA。?
4）對(duì)照設(shè)置：每個(gè)引物都要設(shè)無(wú)模板對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照以及污染對(duì)照。?
PCR實(shí)驗(yàn)步驟
?
引物稀釋：?
根據(jù)引物標(biāo)簽上的nmole量來(lái)稀釋引物，加入nmole量10倍體積的滅菌雙蒸去離子水即得100μM的儲(chǔ)存液，例如nmole=4.1，則加入41μl滅菌雙蒸去離子水即得到該引物濃度為100μM的儲(chǔ)存液。?
探針稀釋：?
同上述引物稀釋。?
推薦逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系（以Promega逆轉(zhuǎn)錄試劑為例）：
|
組份 |
終濃度 |
用量/反應(yīng) |
| 5×RT Buffer |
1× |
4.0 μl |
| dNTP (10 mM) |
0.375 mM |
0.75 μl |
| miRNA RT Primer(1 μM) |
60 nM |
1.20 μl |
| RNasin (40U/μl) |
0.5 U/μl |
0.25 μl |
| MML V Reverse Transcriptase (200U/μl) |
40 U |
0.20 μl |
| RNA Sample |
1-3 μg |
X?μl |
| RNase Free H2O |
— |
To 20μl |
逆轉(zhuǎn)錄程序：
26℃ 40 min；42℃ 40 min；85℃ 10min；4℃ hold.
推薦實(shí)驗(yàn)體系：
| 組份 |
終濃度 |
用量/反應(yīng) |
| 2×Real-time PCR Master Mix（FAM）? |
1× |
10μl |
| miRNA specific?Primer set?(10μM) | ? 0.2?μM | ?0.4?μl |
| miRNA specific?Probe?(10μM) |
0.1?μM-0.2?μM |
0.20 μl-0.4?μl |
| rTaq DNA Polymerase (5U/μl) |
1 U |
0.20 μl |
|
cDNA |
— |
2μl |
| RNase Free H2O |
— |
To 20μl |
|
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|
Real-Time PCR程序:
95℃ 3min（根據(jù)自己的酶類型調(diào)整反應(yīng)時(shí)間）
95℃ 12s
62℃?40?s?(采集熒光)
40 cycles
1. Bastian, I., S. Tam Tam, et al. "Differential expression of microRNA-1 in dorsal root ganglion neurons." Histochemistry and cell biology 135(1): 37-45.
2.Ma, H., Q. Lu, et al. "Functional analysis of the cellulose gene of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, using RNA interference." Genetics and Molecular Research 10(3): 1931-1941.?
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目錄分類 本商品目錄中的產(chǎn)品介紹按以下內(nèi)容分類：
1. RNA干擾研究工具
2. MicroRNA研究工具?
產(chǎn)品價(jià)格 本產(chǎn)品目錄中標(biāo)示的價(jià)格均為國(guó)內(nèi)統(tǒng)一零售參考價(jià)，全部為人民幣價(jià)格。如果大量定購(gòu)時(shí)，在標(biāo)準(zhǔn)價(jià)格的基礎(chǔ)上有不同程度的優(yōu)惠。?
質(zhì)量保證 凡吉瑪公司的產(chǎn)品均有嚴(yán)格的質(zhì)量保證。如果我們發(fā)現(xiàn)確實(shí)存在質(zhì)量問題時(shí)，保證更換產(chǎn)品。如果在到貨后一個(gè)月之內(nèi)用戶無(wú)提出異議，我們將視本產(chǎn)品為優(yōu)良產(chǎn)品而不再受理投訴事宜。提出產(chǎn)品異議（或投訴）時(shí)，切莫在產(chǎn)品使用完（或快使用完）后提出，以備本公司回收產(chǎn)品，確認(rèn)產(chǎn)品質(zhì)量。由于訂錯(cuò)產(chǎn)品而產(chǎn)生的退貨情況，原則上由客戶承擔(dān)相關(guān)費(fèi)用。發(fā)生投訴事宜時(shí)，公司只保證在產(chǎn)品價(jià)格額度范圍之內(nèi)酌情賠償，恕不受理超過(guò)制品價(jià)格額度以上之部分。退款時(shí)需退還原始發(fā)票。
下單前請(qǐng)務(wù)必核對(duì)訂購(gòu)表客戶信息和訂購(gòu)內(nèi)容無(wú)誤，訂單一經(jīng)確認(rèn)，當(dāng)天即啟動(dòng)生產(chǎn)。 超過(guò)當(dāng)日17：00后不能修改或者取消，如果需要取消訂單，由此產(chǎn)生的費(fèi)用，將由客戶承擔(dān)。
【取消訂單費(fèi)用規(guī)則】
（1）當(dāng)日17：00前，免費(fèi)修改或取消。
（2）當(dāng)日17：00到次日17：00前，按該項(xiàng)產(chǎn)品金額的50%收取。
（3）次日17：00后，按該項(xiàng)產(chǎn)品金額的100%收取。