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公司產品
miRNA質粒載體
MicroRNA（miRNA）是一類真核生物內源性的小分子單鏈RNA，通常長為18~25nt，能夠通過與靶mRNA特異性的堿基配對結合，引起靶序列降解或抑制其翻譯，從而對基因進行轉錄后的表達調控。
MicroRNA 表達載體構建
MicroRNA（miRNA）是一類真核生物內源性的小分子單鏈RNA，通常長為18~25nt，能夠通過與靶mRNA特異性的堿基配對結合，引起靶序列降解或抑制其翻譯，從而對基因進行轉錄后的表達調控（如右圖所示）。GenePharma MicroRNA載體利用CMV啟動子可以在眾多哺乳動物細胞中快速、高效、持續表達pre-miRNA，經過Drosha（RNaseⅢ）作用形成small hairpin pre-miRNAs（約70nt），再過Dicer作用形成成熟的microRNA（約22nt），作用靶mRNA，起到表達調控作用。
microRNA過表達載體
吉瑪提供兩種過表達的方式：
1. 從天然的基因組序列中表達pre-miRNA轉錄本構建pre-microRNA。插入序列不僅包含pre-miRNA莖環結構，同時構建100-200bp長的上下游兩端的側翼序列。使用使用pol-Ⅱ（如CMV）啟動子，這種構建方式保證高水平的表達pre-microRNA。表達出來的pre-miRNA的生理活動盡可能接近天然狀態。
使用這種構建方式，客戶只需提供miRNA的具體信息及指定過表達載體類型（如吉瑪pEX系列 M核過表達載體，我們完成序列合成，質粒構建。
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目錄號 |
產品名稱 |
規格 |
價格 |
交貨期限 |
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C09001 |
質粒型microRNA 過表達載體-1 (pre-miRNA+flanking sequences, ~500bp) |
50μg |
￥2,500 |
3-4周 |
2. 利用吉瑪優化過的載體，模擬內源miRNA-155的表達模塊，這種構建方法解決了不同miRNA表達效率差異的問題，同時也有效的避免了有些內源miRNA表達時產生-3p，-5p的問題。miRNA的發夾序列融合在EGFP報告基因的后面，模擬miRNA在體內的成熟過程。
GenePharma microRNA載體元件信息及用途
特征
用途
CMV
promoter
高表達目的基因
EmGFP
利用熒光顯微鏡觀察轉染效果
Blasticidin
resistance gene
可用來篩選穩定細胞系
Spectinomycin
篩選含有已經轉化質粒的E. coli
pUC
origin
質粒可以在E. coli中進行高拷貝
使用這種構建方式，客戶只需提供miRNA的具體信息，我們完成序列合成，質粒構建。
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目錄號 |
產品名稱 |
規格 |
價格 |
交貨期限 |
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C09002 |
質粒型microRNA 過表達載體-2 (pGCMV/EGFP/miR/Blasticidin) |
50μg |
￥1,000 |
2-3周 |
備注：保證插入序列正確，不保證miRNA的過表達效率，不保證轉染效率。所有實驗僅供科研使用。
microRNA抑制子表達載體
吉瑪提供兩種miRNA抑制子載體構建的方式：
1. 利用吉瑪優化過的載體，模擬內源miRNA-155的表達模塊，來表達miRNA inhibitor序列。這種構建與吉瑪miRNA過表達方式2使用同樣的載體系統，方便客戶使用同一套系統完成miRNA的過表達與抑制。
使用這種構建方式，客戶只需提供miRNA的具體信息，我們完成序列合成，質粒構建。
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目錄號 |
產品名稱 |
規格 |
價格 |
交貨期限 |
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C09003 |
質粒型microRNA 抑制子載體-1 (pGCMV/EGFP/miR/Blasticidin) |
50μg |
￥1,000 |
2-3周 |
2. miRNA sponge（海綿）載體構建：吉瑪通過構建載體，表達包含多個成熟miRNA結合位點的RNA序列，通過吸附結合成熟miRNA，從而抑制miRNA的作用，從而進行功能缺失性研究。
miRNA sponge的特點：
a. 由于miR Sponges是由質粒編碼的，它能夠通過真核表達載體達到穩定沉默細胞microRNA的目的；
b. 能夠沉默整個家族的microRNA以達到對整個家族microRNA功能的研究；
c. 可以利用miR Sponges實現體內外loss of function研究；
d. 可以用來檢測luciferase靶基因報告系統分析；
e. 可以自由組合串聯不同miRNA抑制子序列，達到沉默多種不同miRNA的目的。
使用這種構建方式，客戶需提供miRNA的具體信息、預構建miRNA inhibitor的重復數及預構建inhibitor的序列信息，我們完成序列合成，質粒構建。
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目錄號 |
產品名稱 |
規格 |
價格 |
交貨期限 |
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C09004 |
質粒型microRNA 抑制子載體-2 (microRNA inhibitor sponge, 3重復) |
50μg |
￥1,500 |
3周 |
microRNA靶基因熒光素酶報告載體
吉瑪采用Promega的psicheck2.0的載體系統完成靶基因3’ UTR質粒載體構建服務。可提供基于人、小鼠、大鼠基因的UTR構建。
psicheck2.0報告基因檢測系統用來檢測siRNA/miRNA與靶基因是否可能存在調控作用，該報告系統報告熒光(hRluc)，其下游構建了靶基因3’UTR區域，通過對該熒光的監測，即可驗證siRNA/miRNA對該靶標是否有調控作用；另有一校正熒光(hluc) 作為穩定內參，用于監測質粒表達效率。
嚴格的實驗體系，要求miRNA與mRNA 3’ UTR驗證實驗中需要構建靶mRNA的點突變載體，以驗證靶點作用有效性。突變載體構建主要依據預測的miRNA與靶基因3’UTR的穩定結合區域(即種子區)。通過種子區全部堿基或部分堿基突變導致miRNA與靶基因3’UTR區域的結合能力大大降低，從而判斷是否存在miRNA的調控作用。
完成miRNA靶基因報告基因載體構建，需要客戶提供：miRNA具體信息，預測靶基因信息，miRNA與靶mRNA結合位點信息。
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目錄號 |
產品名稱 |
規格 |
價格 |
交貨期限 |
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C08005 |
雙熒光素酶報告實驗載體構建(≤500bp)a |
50μg |
￥2,500 |
3-4周 |
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C08006 |
雙熒光素酶報告實驗突變載體構建（種子區突變）b |
50μg |
￥2,500 |
3-4周 |
注：
a. 靶基因3’ UTR長度須小于500bp，否則價格及合成周期另計；
b. 單位點(即1個miRNA-mRNA作用位點) 突變價格如上，多位點突變價格及合成周期另計。
Lentivirus microRNA表達載體
目錄號
產品名稱
規格
價格
交貨期限
C06001
慢病毒干擾載體LV-1
(pGLVU6/GFP)
50μg
詢價
2周
C06002
慢病毒干擾載體LV-2N
(pGLVU6/Puro)
50μg
詢價
2周
C06003
慢病毒干擾載體LV-3
(pGLVH1/GFP+Puro)
50μg
詢價
2周
C06004
慢病毒干擾載體LV-9N
(pGLVU6/mCherry)
50μg
詢價
2周
C06005
慢病毒干擾載體LV-10N
(pGLVU6/mCherry/Puro)
50μg
詢價
2周
C06006
慢病毒干擾載體LV-12
(pGLVH6/luci05/Puro)
50μg
詢價
2周
C06007
慢病毒干擾載體LV-15N
(pGLVH1/mCherry/Puro)
50μg
詢價
2周
C06008
慢病毒干擾載體LV-16
(pGLVU6/Firefly/Puro)
50μg
詢價
2周
C06027
慢病毒干擾載體 LV-U6-Neo
50μg
詢價
2周
C06028
慢病毒干擾載體 LV-U6-copGFP-T2A-Neo
50μg
詢價
2周
C06029
慢病毒干擾載體 LV-U6-mCherry-T2A-Neo
50μg
詢價
2周
C06030
慢病毒干擾載體 LV-U6-Luci17-T2A-Neo
50μg
詢價
2周
GenePharma microRNA 過表達載體庫
吉瑪公司已經利用自己的miRNA載體骨架成功構建為數眾多的miRNA的過表達載體，載體庫中的miRNA expression vectors 1周之內即可出貨，價格更優。
| Name | Accession | Species | Seqence |
| hsa-miR-155 | MIMAT0000646 | Homo sapiens | UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU |
| hsa-miR-106b | MIMAT0000680 | Homo sapiens | UAAAGUGCUGACAGUGCAGAU |
| hsa-let-7a | MIMAT0000062 | Homo sapiens | UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU |
| hsa-miR-15a | MIMAT0000068 | Homo sapiens | UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG |
| hsa-miR-16 | MIMAT0000069 | Homo sapiens | UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG |
| hsa-miR-17 | MIMAT0000070 | Homo sapiens | CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG |
| hsa-miR-143 | MIMAT0000435 | Homo sapiens | UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC |
| hsa-miR-145 | MIMAT0000437 | Homo sapiens | GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU |
| hsa-miR-125b | MIMAT0000423 | Homo sapiens | UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA |
| hsa-miR-218 | MIMAT0000275 | Homo sapiens | UUGUGCUUGAUCUAACCAUGU |
| hsa-miR-451 | MIMAT0001631 | Homo sapiens | AAACCGUUACCAUUACUGAGUU |
| hsa-miR-148a | MIMAT0000243 | Homo sapiens | UCAGUGCACUACAGAACUUUGU |
| hsa-miR-122 | MIMAT0000421 | Homo sapiens | UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG |
| dre-miR-737 | MIMAT0003768 | Danio rerio | AAUCAAAACCUAAAGAAAAUA |
| hsa-miR-21 | MIMAT0000076 | Homo sapiens | UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA |
| hsa-miR-194 | MIMAT0000460 | Homo sapiens | UGUAACAGCAACUCCAUGUGGA |
| hsa-miR-150 | MIMAT0000451 | Homo sapiens | UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG |
| hsa-miR-491-5p | MIMAT0002807 | Homo sapiens | AGUGGGGAACCCUUCCAUGAGG |
| hsa-miR-15b | MIMAT0000417 | Homo sapiens | UAGCAGCACAUCAUGGUUUACA |
| hsa-miR-29b | MIMAT0000100 | Homo sapiens | UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU |
| hsa-miR-30a | MIMAT0000087 | Homo sapiens | UGUAAACAUCCUCGACUGGAAG |
| hsa-miR-29c | MIMAT0000681 | Homo sapiens | UAGCACCAUUUGAAAUCGGUUA |
| hsa-miR-195 | MIMAT0000461 | Homo sapiens | UAGCAGCACAGAAAUAUUGGC |
| hsa-miR-7 | MIMAT0000252 | Homo sapiens | UGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGU |
| hsa-miR-886-5p | MIMAT0004905 | Homo sapiens | CGGGUCGGAGUUAGCUCAAGCGG |
| hsa-miR-182 | MIMAT0000259 | Homo sapiens | UUUGGCAAUGGUAGAACUCACACU |
| hsa-miR-497 | MIMAT0002820 | Homo sapiens | CAGCAGCACACUGUGGUUUGU |
| hsa-miR-375 | MIMAT0000728 | Homo sapiens | UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGA |
| hsa-miR-26b | MIMAT0000083 | Homo sapiens | UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGU |
| hsa-miR-128 | MIMAT0000424 | Homo sapiens | UCACAGUGAACCGGUCUCUUU |
| hsa-miR-200b | MIMAT0000318 | Homo sapiens | UAAUACUGCCUGGUAAUGAUGA |
| hsa-miR-320a | MIMAT0000510 | Homo sapiens | AAAAGCUGGGUUGAGAGGGCGA |
| hsa-miR-196b | MIMAT0001080 | Homo sapiens | UAGGUAGUUUCCUGUUGUUGGG |
| mmu-miR-19b | MIMAT0000513 | Mus musculus | UGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGA |
| hsa-let-7c | MIMAT0000064 | Homo sapiens | UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU |
| hsa-miR-9 | MIMAT0000441 | Homo sapiens | UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGA |
| hsa-miR-373 | MIMAT0000726 | Homo sapiens | GAAGUGCUUCGAUUUUGGGGUGU |
| hsa-miR-338-3p | MIMAT0000763 | Homo sapiens | UCCAGCAUCAGUGAUUUUGUUG |
| hsa-miR-98 | MIMAT0000096 | Homo sapiens | UGAGGUAGUAAGUUGUAUUGUU |
| hsa-miR-214 | MIMAT0000271 | Homo sapiens | ACAGCAGGCACAGACAGGCAGU |
| dre-miR-16a | MIMAT0001774 | Danio rerio | UAGCAGCACGUAAAUAUUGGUG |
| bta-miR-139 | MIMAT0003788 | Bos taurus | UCUACAGUGCACGUGUCUCCAGU |
| bta-miR-30d | MIMAT0003533 | Bos taurus | UGUAAACAUCCCCGACUGGAAGCU |
| hsa-miR-26a | MIMAT0000082 | Homo sapiens | UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU |
GenePharma MicroRNA載體簡介
MicroRNA（miRNA）是一類真核生物內源性的小分子單鏈RNA，通常長為18~25nt，能夠通過與靶mRNA特異性的堿基配對結合，引起靶序列降解或抑制其翻譯，從而對基因進行轉錄后的表達調控（如右圖所示）。GenePharma MicroRNA載體利用CMV啟動子可以在眾多哺乳動物細胞中快速、高效、持續表達pre-miRNA，經過Drosha（RNaseⅢ）作用形成small hairpin pre-miRNAs（約70nt），再過Dicer作用形成成熟的microRNA（約22nt），作用靶mRNA，起到表達調控作用。
GenePharma MicroRNA-neg-control實驗設計
在使用載體法針對某一MicroRNA進行過表達研究過程中，通常會遇到如下幾個問題：實驗對照組的確立、細胞轉染條件的確定、基因表達效率的檢測。
實驗對照組的確立
在一個完善的MicroRNA表達實驗設計中，必須考慮設立正確合理的實驗對照組。通常，這些對照組包括載體陰性對照組、轉染試劑對照組。
載體陰性對照可以有兩種，一種是采用通用的陰性對照組，在本試劑盒中包括了該對照所需的載體（microRNA），可以表達與目的基因序列無同源性的microRNA片段；另一種是將目的microRNA的序列打亂后重新組合所得的陰性對照（scrambled）。
對照組的設立對于MicroRNA表達研究是很有必要的，您可以利用載體對照來確認microRNA實驗中轉染、RNA提取和基因表達檢測方法的可靠性。本試劑盒中包括GenePharma MicroRNA-NC過表達載體的對照，該載體在導入細胞中后，可以有效反應載體轉染難易以及作為基因表達、RNA提取、基因檢測等系統參考。
細胞轉染條件的確定
使用MicroRNA載體轉染細胞時，為了選擇合適的轉染方法和確定轉染效率，通常采用報告基因來檢測DNA的導入情況。最常用的報告基因是綠色熒光蛋白。吉瑪公司提供的MicroRNA表達載體包含綠色熒光蛋白的表達框架，轉入細胞后可以表達綠色熒光蛋白，用熒光顯微鏡或流式細胞儀可以很容易的確定轉染效率。
MicroRNA表達的檢測
通常用兩大類方法來檢測MicroRNA表達效率，一類方法是直接檢測MicroRNA的變化水平，常用的方法如northern雜交、芯片（microarrays）以及核糖核酸酶保護分析，但這些傳統的方法都需要用到標記探針與純化的RNA進行雜交，由于成熟的miRNAs及其前體共享一段共同的靶序列，而且目前的這些方法有無法通過大小將其分開，因此很難專一識別成熟的MicroRNA，導致較高的背景信號。基于此，吉瑪公司開發出Hairpin-itTM MicroRNAs qPCR Quantitation Kit，可以對任何種MicroRNAs 進行定量PCR檢測，另外我們也可以根據客戶要求制定特殊服務。 和另一類方法是通過檢測目的基因的生物學效應和細胞效應來間接的反映目的基因的表達變化，這一類方法很多，不同的基因有不同的檢測方法。通常選用直接檢測MicroRNA的變化情況，可以很直觀地反映基因的真實情況，不過也有一部分研究人員通過檢測細胞效應如細胞增殖速率等指標間接反映基因變化。
GenePharma microRNA 過表達載體基本信息介紹
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GenePharma microRNA載體元件信息及用途 |
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特征 |
用途 |
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CMV promoter |
高表達目的基因 |
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EmGFP |
利用熒光顯微鏡觀察轉染效果 |
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Blasticidin resistance gene |
可用來篩選穩定細胞系 |
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Spectinomycin |
篩選含有已經轉化質粒的E. coli |
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pUC origin |
質粒可以在E. coli中進行高拷貝 |
GenePharma miRNA質粒載體細胞轉染方法
由于在MicroRNA表達實驗設計中有多種條件選擇如試劑和細胞株等，在本實驗操作中以GenePharma MicroRNA-neg-control為對照，RNAi-Mate(或LipofectamineTM2000)為轉染試劑，Hela細胞為實驗細胞株，按照上述條件分步闡述MicroRNA實驗的操作過程。如果用戶使用不同的細胞株和轉染試劑，可根據相應參考文獻進行調整。
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1 轉染條件的確定 您可選用表達綠色熒光蛋白直接來確定轉染效率； 選用生理狀態良好的細胞對提高轉染效率很重要。DNA的用量及其與轉染試劑的比例可在推薦范圍內適當調整。 |
轉染前一天，接種0.4-1.0×105細胞/孔至24孔板中，加入500μl含血清培養液，37oC 5% CO2培養至40-70%融合。 |
| 在50 μl Opti-MEM I培養液或其它無血清培養液中加入0.5-0.8μg DNA，混勻。 | |
| 使用前輕輕混勻RNAi-Mate試劑，切忌離心處理。用30μl無血清的DMEM或Opti-MEM，或其他無血清培養基）稀釋1-4μg RNAi-Mate試劑（可以分別設立DNA/RNAi-Mate的不同用量組，通常DNA和RNAi-Mate的用量在1：2-1：5范圍內，針對不同的細胞需要不同的用量），輕輕混勻，室溫放置5分鐘。 | |
| 將稀釋好的DNA和RNAi-Mate試劑混合，定容到100μl；輕柔混勻，室溫放置30分鐘，以便形成DNA-Mate復合物。 | |
| 將100μl DNA/RNAi-Mate復合物加到含有細胞和培養基的培養板的孔中，來回輕柔搖晃細胞培養板板，使DNA/RNAi-Mate混合物均勻覆蓋細胞。 | |
| 細胞在CO2培養箱中37℃溫育24h-48h后，進行轉染后的其它檢測步驟。如果細胞株比較敏感，孵育4-6小時后，除去復合物，更換培養基。 | |
| 通過表達綠色熒光蛋白的DNA載體來檢測細胞的轉染效率，細胞轉染后24-48 h后，使用熒光顯微鏡觀察計數表達綠色熒光蛋白的細胞，在明場觀察計數同一視野中的總細胞數，轉染細胞率=熒光蛋白表達細胞數/總細胞數×100%。或使用DAPI等染料染核后，使用流式細胞儀進行計數，然后計算轉染效率。 | |
| 如果在轉染條件摸索實驗中沒有找到較高效率的轉染方法，請更換轉染方法和試劑。如無其他方法選擇，可以使用流式細胞儀將轉染的細胞分選出來用于后續實驗。如果無法分選細胞，可以在計算RNA干擾抑制效率時去除轉染效率的影響，也可以使用抗生素對轉染后的細胞進行初篩后再進一步檢測抑制效率。 | |
| 2 細胞的轉染 | 設定合理的實驗組，包括轉染試劑對照（mock transfection）、陰性對照(negative control)和目的基因實驗組。 |
| 按照前面實驗確定的細胞接種量接種。37oC 5% CO2培養至40-70%融合。 | |
| 按照前面實驗確定的轉染條件轉染細胞。如果需要轉染不同培養量的細胞，試劑的用量可以根據相關參考進行相應的變化。 | |
| 轉染后24-48h后，收集細胞進行下一步的檢測工作。通常，目的基因在轉染后24-48h內就會表現出現表達，但有一些蛋白比如穩定性較強、半衰期較長的蛋白在轉染后含量降低比較緩慢，所以需要延長檢測時間。 | |
| 3 穩定細胞系建立 | 前一天，準備健康細胞，密度在20%-40%。 |
| MicroRNA表達載體和對照，按照轉染試劑推薦要求，進行細胞轉染，6小時后換成新鮮培養液，培養過夜。 | |
| 第二天，胰酶消化，將細胞轉入較大的培養瓶中（如6孔板轉到10cm plates），加入完全培養液并含有適當濃度的Blasticidin。 | |
| 每3-4天更換含有適當濃度的Blasticidin，直到Blasticidin抗性克隆形成（一般需要11-14天藥物篩選）。 | |
| 挑取至少10個耐藥克隆進行擴增。 | |
| 4 基因抑制效率的檢測 | 在本公司的《RNAi產品使用手冊》（14頁-19頁）中較詳細地介紹了使用熒光定量PCR技術和Western blot方法檢測目的基因表達變化的操作步驟和注意事項，用戶可以酌情選用。 |
| 用戶也可選用其他間接的方法（如目的基因的生物學功能或細胞生物學特性的變化）來檢測目的基因的抑制情況。鑒于這方面的檢測手段多種多樣，需要用戶自己進行選擇，在此不再贅述。 |
Li J, Wang F, Wang G, Sun Y, Cai J, Liu X, Zhang J, Lu X, Li Y, Chen M, Chen L, Jiang C. Combination epidermal growth factor receptor variant III peptide-pulsed dendritic cell vaccine with miR-326 results in enhanced killing on EGFRvIII-positive cells. Oncotarget. 2017 Apr 18; 8(16): 26256-68.
Zhang, H., M. Qi, et al. "microRNA-9 targets matrix metalloproteinase 14 to inhibit invasion, metastasis, and angiogenesis of neuroblastoma cells." Molecular Cancer Therapeutics 11(7): 1454-1466.
Liang, G. F., S. Chen, et al. "Construction of MiRNA Eukaryotic Expression Vector and its Stable Expression in Human Liver Cancer Cells." Procedia Environmental Sciences 8: 451-456.
Zhang, H., J. Pu, et al. "MicroRNA-145 inhibits the growth, invasion, metastasis and angiogenesis of neuroblastoma cells through targeting hypoxia-inducible factor 2 alpha." Oncogene.
Zheng, L., J. Pu, et al. "microRNA-145 targets v-ets erythroblastosis virus E26 oncogene homolog 1 to suppress the invasion, metastasis and angiogenesis of gastric cancer cells." Molecular Cancer Research.
目錄分類 本商品目錄中的產品介紹按以下內容分類：
1. RNA干擾研究工具
2. MicroRNA研究工具
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