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RNAi對照
吉瑪可以提供陰性和陽性siRNA對照
陰性對照: 通用對照(NC),固定序列,與人,大鼠,小鼠轉錄組比對無同源性。
? ? ? ? ? ? ? ? ?定制序列對照(scramble NC):?根據客戶提供siRNA序列打亂,與轉錄組比對無同源性。
陽性對照(部分基因):GAPDH,b-actin,GFP等
A. 陰性對照 |
|
吉瑪可提供與目的基因序列無同源性的通用陰性對照和將選中的siRNA序列打亂(scrambled)的陰性對照 | 1. siRNA實驗應該有陰性對照; |
2. 通用陰性對照為與目的基因的序列無同源性的普通陰性對照; | |
3. Scrambled陰性對照和選中的siRNA序列有相同的組成,但是和mRNA沒有明顯的同源性; | |
4. 陰性對照需要確定和目的靶細胞中其它基因沒有同源性。 |
B. 熒光標記(FAM)的陰性對照 | |
吉瑪可提供與目的基因序列無同源性的FAM標記的通用陰性對照 | 1. 通用陰性對照為與目的基因的序列無同源性的普通陰性對照; |
2. 通過標記熒光,可以方便地在熒光顯微鏡下觀察轉染情況; | |
3. 可用于優化轉染條件和評價轉染效率; | |
4. 具備很好的pH耐受性,在活細胞中更穩定。 |
目錄號 |
產品名稱 |
規格 |
純化方式 |
價格 |
交貨期限 |
A06001 |
陰性對照siRNA |
1 OD |
HPLC |
¥120 |
2個工作日 |
A07001 |
FAM標記陰性對照siRNA |
1 OD |
HPLC |
¥150 |
2個工作日 |
C. 陽性對照 |
吉瑪公司可提供的常用的siRNA陽性對照 |
陽性對照作為一個實驗系統檢查是很重要的。也就是說,當您看到siRNA陽性對照的預期實驗結果時,您能確保在您的實驗方法中您的轉染、RNA提取物和檢測方法是可靠的 |
1. GFP-274 |
2. Luciferase GL2 |
|
3. GAPDH(human/mouse/rat) |
|
4. β-actin (human/mouse/rat) |
|
5. P53 |
|
6. lamin A/C |
目錄號 |
產品名稱 |
規格 |
純化方式 |
價格 |
交貨期限 |
A08001 |
陽性對照siRNA, LaminA/C |
1 OD |
HPLC |
¥120 |
4個工作日 |
A08002 |
陽性對照siRNA, GFP274 |
1 OD |
HPLC |
¥120 |
2個工作日 |
A08003 |
陽性對照siRNA, Luciferase GL2 |
1 OD |
HPLC |
¥120 |
4個工作日 |
A08004 |
陽性對照siRNA, MAPK1 |
1 OD |
HPLC |
¥120 |
4個工作日 |
A08005 |
陽性對照siRNA, Beta-Actin |
1 OD |
HPLC |
¥120 |
2個工作日 |
A08006 |
陽性對照siRNA, Vimentin |
1 OD |
HPLC |
¥120 |
4個工作日 |
A08007 |
陽性對照siRNA, P53 |
1 OD |
HPLC |
¥120 |
2個工作日 |
A08008 |
陽性對照siRNA, GAPDH |
1 OD |
HPLC |
¥120 |
2個工作日 |
A08009 |
陽性對照siRNA, Cyclophilin B |
1 OD |
HPLC |
¥120 |
4個工作日 |
D. 轉染試劑對照 |
對于一個完善的對照系統,轉染試劑對照(Mock transfection )是不可缺的。轉染試劑對照可以檢測轉染試劑對細胞的毒性、細胞的成活率等細胞轉染的各個因素影響。 |
我們推薦使用我們公司最新的GenePharma轉染試劑 。(見轉染試劑)
目錄號 |
產品名稱 |
規格 |
價格 |
交貨期限 |
G04001 |
RNAi-Mate轉染試劑 |
0.1ml |
¥150 |
2個工作日 |
G04002 |
siRNA-Mate轉染試劑 |
0.1ml |
¥150 |
2個工作日 |
G04003 |
siRNA-Mate轉染試劑 |
1ml |
¥1,500 |
2個工作日 |
G04008 |
GP-transfect-Mate |
0.1ml |
¥150 |
2個工作日 |
G04009 |
GP-transfect-Mate |
1ml |
¥1,500 |
2個工作日 |
E. 避免脫靶效應對照 |
對于RNAi研究來說,在哺乳動物中,脫靶效應是一個十分關注的問題。有大量的報道,一個siRNA影響多個基因的表達。因此,大量研究關注于用針對同一個基因的不同區域的多個siRNA進行實驗,然后分析各自對基因表達效果的影響。理想的結果是針對不同區域的siRNA對同一個靶基因產生相似的干擾效果。吉瑪公司的技術人員為您針對同一個靶基因設計多對siRNA oligos,為您解決脫靶效應的難題。 |
注: NC序列是大量文獻引用的一段序列,和所有的哺乳動物都沒有同源性,適用于大鼠、小鼠、人等不同基因的研究。
FAM-siRNA 對照產品的溶解及保存
1.1 由于OligoRNA很輕的干膜狀附在管壁上,打開時極易散失,所以打開離心管前先離心,然后再慢慢打開管蓋,溶解時加適量DEPC水后蓋上管蓋,振蕩溶解。
1.2? 1OD≈33ug≈2.5nmol為了得到20uM的濃度,應該使用125ul附送的DEPC水去重懸1OD的siRNA,溶解后為20uM的樣品。
1.3 貯存和穩定性:-20℃,熒光標記產品需要避光保存。液體(貯存濃度為20μM)溶解后分裝,避免反復凍融,3個月內用完;-20或者-80保存下siRNA oligo 干粉的穩定性可達到6個月,使用的管子、槍頭要無酶處理。
熒光標記的siRNA
轉染效率的高低可以通過熒光標記的siRNA(FAM-siRNA)實現。
FAM-siRNA 轉染細胞后,可以用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、流式細胞儀等檢測,確定是否有效轉染和優化轉染條件。FAM-siRNA 還可用作siRNA 胞內定位及雙標記實驗(配合標記抗體)來追蹤轉染過程中導入了siRNA 的細胞,將轉染與靶蛋白表達的下調結合起來。? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ??
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 圖1. FAM-NC轉染細胞后的熒光
? ? ? ??
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 圖2. CY3-NC轉染細胞后的熒光圖? ? ?
? ? ???
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 圖3. 以B為校準hACTB為內參hGAPDH基因表達水平
A.siRNA轉染的方法
哺乳動物轉染的常見方法有:磷酸鈣共沉淀、電穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene、機械法(例如,顯微注射和基因槍)、陽離子脂質體試劑,其中陽離子脂質體試劑轉染法是目前最常用的轉染方法。
應用脂質體型轉染試劑進行轉染需要注重的幾個方面:轉染試劑的用量、siRNA的用量、轉染時的細胞密度、轉染時的操作順序、細胞與轉染試劑/siRNA復合物的溫浴的時間
GP-transfect-Mate?操作流程(24?孔板)
以24 孔板為例,若要檢測基因沉默或者過表達效果,推薦最低RNA oligo終濃度為50nM
(DNA為0.5~1.5μg);遵循以下操作方法可以高效地將RNA? oligo或者DNA轉染貼壁和懸浮培養的多種真核細胞。但是對某些特殊的細胞系和培養條件,或特殊應用等,也需要單獨特別優化,請參考表 1、表2。
1.???????細胞鋪板
轉染時細胞密度:一般來說,當細胞密度達到60%~80%時進行轉染可以取得較高的轉染效率(參見表1)。然而,不同細胞的最適轉染密度都不盡相同,因此在初次轉染某種細胞時,可以通過預實驗先確認該細胞最佳的轉染密度。
2.?轉染復合物的制備
(1)將 GP-transfect-Mate轉染試劑放置于室溫中,使用前輕輕混勻。
(2)在1.5 ml無菌離心管中加入50 μl無血清培養基或 OPTI-MEM,并添加適量的轉染試劑(參見表2),用移液器輕輕混勻,室溫靜置5 min。
(3)同時在另一1.5 ml無菌離心管中加入50 μl無血清培養基或 OPTI-MEM,并添加適量的RNA oligo/DNA (參見表2),用移液器輕輕混勻,室溫靜置5 min。
(4)將GP-transfect-Mate-培養基混合物滴加至RNA oligo/DNA-培養基混合物中,用移液器輕輕混勻,室溫靜置15-20 min 后,立即轉染。
注:復合物盡量在60 min內使用,并且GP-transfect-Mate-培養基混合物和RNA oligo/DNA-培養基混合物的混合次序非常重要,切勿顛倒。
3.?轉染過程
(1)趁靜置時,給 24 孔板換液,每孔換上 0.4ml 預熱的新鮮培養基。
(2)將 100 μl 轉染混合物加入孔中,終體系為500 μl。加完后將板輕輕晃動以使復合物均勻分布。
(3)37℃靜置培養細胞,4-6h換成完全培養基。24-72 h檢測mRNA表達,48-96 h檢測蛋白表達。
適用范圍
293T, A549, Beas-2B,HeLa,ECA-109,Raw264.7,A375,CAFs,HCT116,HT29,LMH,NE-4C,MGC803,PC-3, PC-12,MCF-7,C6等細胞。
表?1:?貼壁細胞或懸浮細胞接種數量、培養基體積
培養器皿
每孔表面積(cm2)
每孔培養基的體積(ml)
貼壁細胞轉染前一天接種密度
懸浮細胞轉染當天接種密度
96?孔板
0.3
0.1
5 000±2 500
2-5×104
24?孔板
2
0.5
25000±10 000
1-2.5×105
12?孔板
4
1
50000±20 000
2-5×105
6?孔板
10
2
150000±50 000
0.4-1×106
60mm
20
4
400000±100 000
1-2.5×106
100mm
60
10
1*106±250 000
2-5×106
注:貼壁細胞培養密度取決于培養器皿的表面積,而懸浮細胞則由培養基的體積決定。
表?2?不同培養板轉染DNA/RNA??oligo的推薦轉染條件
培養器皿 |
Growth Medium |
Opti-MEM/ Serum-free Mediumfor complex |
DNA?轉染 |
RNA轉染 |
||
DNA/μg |
轉染試劑/μl |
RNA/pmol |
轉染試劑/μl |
|||
96?孔板 |
100 μl |
2×10μl |
0.2 |
0.4-1 |
20 |
0.5-1 |
24?孔板 |
500 μl |
2×50μl |
0.6 |
1.2-3 |
40 |
1-3 |
12?孔板 |
1ml |
2×100μl |
1.5 |
3-6 |
80 |
3-5 |
6?孔板 |
2 ml |
2×200 μl |
3 |
6-12.5 |
150 |
5-8 |
60mm |
5ml |
2×500 μl |
6-10 |
12-20 |
300 |
10-20 |
100mm |
10 ml |
2×1ml |
15-30 |
30-60 |
500 |
25-35 |
注:GP-transfect-Mate轉染試劑的用量在此范圍內進行優化。
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目錄分類 本商品目錄中的產品介紹按以下內容分類:
1. RNA干擾研究工具
2. MicroRNA研究工具?
產品價格 本產品目錄中標示的價格均為國內統一零售參考價,全部為人民幣價格。如果大量定購時,在標準價格的基礎上有不同程度的優惠。?
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(3)次日17:00后,按該項產品金額的100%收取。
GPL4-RL | |
LV3(H1/GFP&Puro) | |
LV3(H1/GFP&Puro) |