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熒光標記的siRNA

我們可對siRNA末端用多種熒光標記物進行標記。標記后的siRNA可用流式細胞儀、熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡等觀察到，確定轉染效率，優化轉染條件;標記的siRNA還可用作siRNA胞內定位及雙標記實驗（配合標記抗體）來追蹤轉染過程中導入了siRNA的細胞，將轉染與靶蛋白表達的下調結合起來。

產品描述

我們可對siRNA末端用多種熒光標記物進行標記，反義鏈5'端標記會影響其基因沉默活性，所以不推薦在這一位點進行標記，在其他三個末端修飾對沉默活性幾乎沒有影響。我們推薦在正義鏈的5'端修飾，目前公認這是最佳的化學標記位點。

siRNA標記的熒光基團染料大體上有3類：6-羧基熒光素染料，花青素染料和羅丹明染料，吉瑪基因能為客戶提供多品種類修飾的熒光標記。

熒光素染料修飾： 5'-Fluorescein CE Phosphoramidite (6-Fam)，顏色：Green/yellow。

5'-Tetrachloro-Fluorescein CE Phosphoramidite (TET)，顏色：Orange/yellow。

5’-Hexachloro-Fluorescein CE Phosphoramidite (HEX)，顏色：Pink。

1. FAM/TET/HEX 是最常用的熒光染料,化學合成簡單，收率高，能夠幫助優化各種細胞的轉染條件，跟蹤RNA在細胞或者動物的位置分布。

2. 熒光的最佳工作PH值范圍在7.5~8.3 .

3. FAM/TET/HEX標記的Oligo要避光，干粉，-20℃貯存，不可以在氨水中。

花青素染料修飾： Quasar570 CE Phosphoramidite (Cy3)，顏色：Dark pink/Red。

Quasar670 CE Phosphoramidite (Cy5)，顏色：Far red。

1. 本公司是以Quasar染料代替Cy染料修飾，屬花青素染料類，深粉紅色，它們的吸收波長和激發波長相似. Quasar染料比CY類標計的Oligo要更穩定。

2. 具有穩定的熒光，能夠幫助優化各種細胞的轉染條件，跟蹤RNA在細胞或者動物的位置分布。

羅丹明染料修飾：CAL Fluor Red 610 CE phosphoramidite, 顏色：Orange/red。

TAMRA，顏色：Red。

1. CAL Fluor Red 610可以作為Texas Red（德克薩斯紅）或ROX dyes的替代物與BHQ-2配合使用。

2. TAMRA 既可做發光基團又可做淬滅基團，由于TAMRA發射光譜比較寬，一般用作淬滅基團。

各種熒光染料的激發波長和吸收波長見下表：

Dye	Absorption wavelength	Emission wavelength	Colour
FAM	495	520	Green/yellow
TET	525	550	Orange/yellow
HEX	535	565	Pink
Quasar 570(cy3)	550	570	Dark pink/Red
TAMRA	550	575	Red
ROX	580	605	Purple
CAL Fluor Red 610	590	610	Orange /red
Quasar 670(cy5)	650	670	Far red

本公司提供的siRNA相關產品直接作用于靶基因mRNA，因此我們建議您在收到我們的相關產品后先進行實時定量PCR檢測，以確定靶基因mRNA表達水平的變化，進而直接確認我們合成或構建的siRNA產品是否有效 .

功能介紹與實驗實例

siRNA Real-Time PCR結果分析

對于RNAi實驗而言，我們通常需要知道的是某一特定細胞在導入siRNA前后某一特定基因的表達變化情況來判斷siRNA起到了Gene Knockdown作用。應用熒光定量PCR的方法，可以通過兩種途徑來實現上述判斷，一是測定特定細胞在導入siRNA前后某一特定基因mRNA數量的變化，即為絕對定量；二是通過檢測特定基因與某一管家基因在在導入siRNA前后相對表達情況的變化，即為相對定量。通常采用相對定量的方法來檢測siRNA的Gene Knockdown作用。

1．Real-Time PCR 實驗設計

Real-Time PCR實驗設計時應包括實驗組（導入siRNA），陰性對照（Negative Control）和Mock Transfaction三組。每組至少三個重復。各組同時檢測目標基因和管家基因的Ct值。下例中以GAPDH為管家基因。

2．Real-Time PCR得到siRNA導入前后目標基因和管家基因的Ct值

各組重復實驗的Ct值差異不能過大；一般地，重復實驗Ct值差異在1以內是可以接受的。

實驗組		陰性對照（NC）		Mock Transfection
Target Gene	GAPDH	Target Gene	GAPDH	Target Gene	GAPDH
30.40	23.63	24.21	22.66	26.21	24.60
30.35	23.40	24.60	22.56	26.15	24.31
30.41	23.52	24.66	22.48	26.35	24.72

3．Real-Time PCR數據分析

以Mock Tansfection為對照（Calibrator），管家基因為Normalizer，ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)實驗組－( Ct目的基因- Ct管家基因)對照

	Target Gene	GAPDH	ΔCt	ΔΔCt	Target Gene
	Average Ct	Average Ct	Target Gene–GAPDH	ΔCt–ΔCt, Mock	Rel. to Mock
Mock	26.24±0.10	24.54±0.21	1.7±0.21	0.00±0.21	1.0(1.16－0.86)
實驗組	30.39±0.09*1	23.51±0.15*2	6.88±0.17*3	5.18±0.17	0.027(0.024?0.031)
NC	24.49±0.24	22.56±0.09	1.93±0.25	0.23±0.25	0.85(0.71－1.01)
注：1 為同一樣本重復實驗的Ct值的標準偏差，可用Excel 計算得到；? 2 計算公式為，例如＝0.17 *3 計算公式為2－△△Ct+S 和2－△△Ct－S，S為△△Ct的標準偏差，例如 2－(－2.5+0.10) ＝5.3

使用方法

一、熒光標記的siRNA

轉染效率的高低可以通過熒光標記的siRNA（FAM-siRNA）實現。?
FAM-siRNA 轉染細胞后，可以用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、流式細胞儀等檢測，確定是否有效轉染和優化轉染條件。FAM-siRNA 還可用作siRNA 胞內定位及雙標記實驗（配合標記抗體）來追蹤轉染過程中導入了siRNA 的細胞，將轉染與靶蛋白表達的下調結合起來。?

二、使用熒光標記的siRNA（FAM-siRNA）檢測轉染效率?

1 FAM-siRNA的溶解及保存?
1.1 由于OligoRNA很輕的干膜狀附在管壁上，打開時極易散失，所以打開離心管前先離心，然后再慢慢打開管蓋，溶解時加適量DEPC水后蓋上管蓋，振蕩溶解。?
1.2 需要濃度20uM的樣品，如何計算重懸siRNA緩沖液的量？你購買了1OD的siRNA，想溶解為20uM 的樣品，應該使用150ul附送的DEPC水去重懸1OD的siRNA,溶解后為20uM的樣品。?
1.3 貯存和穩定性：-20℃，避光保存，凍干粉或液體。液體（貯存濃度為20μM）避免反復凍融，GenePharma保證在上述條件下siRNA oligo的穩定性可達到6個月。?

2 轉染?
2.1 使用lipofectamin2000 轉染的步驟（以貼壁細胞為例，僅供參考）?
(1)以24孔培養板操作為例（其他孔板各種的試劑用量，請參照“Lipofectamine2000 manual”），轉染前一天，將0.5~2X105個細胞接種于培養板中，每孔中加入約500ul無抗生素的培養基，使轉染時的細胞密度能夠達到30～50％；?
(2) 取1μl/孔 Lipofectamine2000（使用前輕輕搖勻），用50μl Opti-MEM I Reduced Serum Medium稀釋。輕輕混和后在室溫孵育5 min；?
(3) 取2ul FAM-siRNA，用50μl Opti-MEM I Reduced Serum Medium 稀釋，輕輕混和均勻;
(4) 稀釋的Lipofectamine2000（2）經過5min 的孵育后，與稀釋FAM-siRNA（3）輕輕混和，室溫靜置20min，以形成FAM-siRNA-轉染試劑混和物，如果溶液出現渾濁，屬于正常現象，不會影響轉染效果。?
注意：稀釋的Lipofectamine2000（2）盡量在25min 之內，和稀釋的FAM-siRNA 混和，如果放置時間過長，可能導致轉染試劑活性的降低;
(5) 將FAM-siRNA-轉染試劑混和液（4）加入含有細胞及培養液（約含400ul）的孔中，輕輕搖晃孔板，使混和；?
(6) 在37 ℃的CO2 培養箱中培養，4-6 小時后可將培養基換為含血清的完全培養基(該步驟可以省略);
(7)轉染6小時后即可檢測轉染效率：流式細胞儀、熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡等（見后面）。?

2.2 轉染操作注意事項：?

（1）FAM-siRNA 的轉染過程和普通siRNA 是一樣的，注意整個實驗過程要盡量避光，建議轉染時室內和超凈臺內不要開燈；?
（2）保持FAM-siRNA 管外有錫紙包裹，在靜置lipo-siRNA 過程中盡量避光，?
（3）轉染操作盡量快，操作時間盡量短，操作完畢請盡快將培養板放到培養箱。?
（4）一般來說，使用Lipofectamine 2000 作為轉染試劑，4～6 小時就可以保證siRNA 轉染進入細胞。因此轉染效率的檢測可以在轉染后6小時（轉染過程完成）進行。

3、觀察與檢測?

3.1 檢測方法：熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、流式細胞儀?
3.2 熒光顯微鏡觀察注意事項（流式細胞儀或激光共聚焦顯微鏡檢測請參照儀器說明書）：?
（1）FAM 是一種綠色熒光基團，由藍光激發，激發波長480nm，發射波長520nm。?
（2）使用Lipofectamine 2000 轉染后6 小時就可以檢測，檢測前細胞處理等操作都必須避光！對于檢測的時間要求相對不是特別嚴格，成功轉染的細胞如果沒有受到強光刺激的話，熒光一般不會消失，我們建議盡量在轉染后24 小時內完成檢測。?
（3）確保熟悉熒光顯微鏡操作。建議檢測時，可以先使光路先對準沒有轉染FAM -siRNA的孔，調好焦距打開激發光，一切準備就緒后再進行觀察（一般情況下可以馬上看到熒光）。?
（4）觀察時間不宜過長，盡量避免熒光被猝滅，光路對準轉染孔，馬上觀察和拍照。拍完熒光照片后，最好在同一視野中拍下明場的細胞照片。?
（5）只有成功轉染的細胞才能看到FAM 綠色熒光，與綠色熒光蛋白GFP 的熒光不太一樣，FAM 的熒光比較弱，散在分布在細胞質中。?
（6）由于熒光容易猝滅，應用計數的方法計算轉染效率效果不好，最好用流式細胞儀檢測。?
（7）如果您對我們FAM-siRNA 質量有任何質疑的話，您可以從中吸取少量（2～5μl）FAM-siRNA，加在載玻片上，蓋上蓋玻片，直接于熒光顯微鏡下觀察。注意保證FAM-siRNA 的保存和使用方法無誤，另外，所有操作都必須在避光條件下進行。

產品說明書

http://www.wdodo.com.cn/pdf/index.php?id=48

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1. RNA干擾研究工具
2. MicroRNA研究工具?

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