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GSP在擴(kuò)增低豐度的轉(zhuǎn)錄本時(shí)是最好的。OligodT引物建議用于高質(zhì)量RNA及全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的逆轉(zhuǎn)錄；隨機(jī)引物用于mRNA片段的逆轉(zhuǎn)錄。
通常是由于對(duì)照RNA中含有痕量DNA而導(dǎo)致的。由于進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄時(shí)不可能將所有的DNA模板消除建議可將第一鏈cDNA稀釋1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染所造成的影響。 有可能是引物二聚體的條帶
大多數(shù)情況下是由于退火溫度過(guò)低而導(dǎo)致的非特異性的起始及延伸產(chǎn)生的 對(duì)于長(zhǎng)片段的PCR，建議將反應(yīng)體系中cDNA的濃度稀釋至1:10（或1:100-1:200）
在PCR反應(yīng)體系中第一鏈產(chǎn)物的含量過(guò)高 減少引物的用量 優(yōu)化PCR反應(yīng)條件/減少PCR的循環(huán)次數(shù) 在用DNase處理被DNA污染的RNA樣品時(shí)，其產(chǎn)生的寡核苷酸片段會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，一般會(huì)顯示為彌散背景。
用RT陰性對(duì)照檢測(cè)是否被基因組DNA污染。如果RT陰性對(duì)照的PCR結(jié)果也顯示同樣條帶，則需要用DNase I重新處理樣品。 在PCR反應(yīng)中，非特異的起始擴(kuò)增將導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性結(jié)果。在低于引物Tm 2至5℃的溫度下進(jìn)行退火，降低鎂離子或是目的DNA的量將減少非特異性結(jié)果的產(chǎn)生。 由于mRNA剪切方式的不同，根據(jù)選擇引物的不同將導(dǎo)致產(chǎn)生不同的RT-PCR結(jié)果。
最常見的原因在于您的反應(yīng)體系是PCR的反應(yīng)體系而不是RT-PCR的反應(yīng)體系 與反應(yīng)起始時(shí)RNA的總量及純度有關(guān) 建議在試驗(yàn)中加入對(duì)照RNA 第一鏈的反應(yīng)產(chǎn)物在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，在總的反應(yīng)體系中的含量不要超過(guò)1/10 建議用Oligo(dT)或隨機(jī)引物代替基因特異性引物（GSP）用于第一鏈合成。由于RNA模板存在二級(jí)結(jié)構(gòu)，如環(huán)狀結(jié)果，有可能導(dǎo)致GSP無(wú)法與模板退火；或SSⅡ反轉(zhuǎn)錄酶無(wú)法從此引物進(jìn)行有效延伸。 目的mRNA中含有強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄中止位點(diǎn)，可以試用以下方法解決： a. 將第一鏈的反應(yīng)溫度提高至50℃。 b. 使用隨機(jī)六聚體代替Oligo(dT)進(jìn)行第一鏈反應(yīng)。
human U6 promoter表達(dá)框包括human U6 promoter、終止碼TTTTT和中間自行設(shè)計(jì)的抑制序列或抑制序列的發(fā)卡結(jié)構(gòu)。從人基因組中可以擴(kuò)增出U6 promoter，后面的序列全部自己設(shè)計(jì)。
可能原因是stem的長(zhǎng)度剛好和primer相當(dāng)，所以primer退火時(shí)hairpin結(jié)構(gòu)也形成，從而影響測(cè)序。分析一下發(fā)現(xiàn)它與stem的長(zhǎng)度及序列有關(guān)。冷泉港推薦改變sense strand上幾個(gè)堿基，使其在DNA水平不互補(bǔ)，但RNA卻能利用G-U互補(bǔ)形成hairpin。
目前發(fā)表的RNAi表達(dá)載體大多采用3型Pol III啟動(dòng)子，如human/mouse U6啟動(dòng)子等。其中人U6啟動(dòng)子有幾個(gè)明顯的特點(diǎn)：1.具有TATA box，位于-30~-25bp，被Pol III轉(zhuǎn)錄；2.在轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游-66~47bp處存在PSE(proximal sequence element)，該元件是snRNA激活因子蛋白復(fù)合物的結(jié)合位點(diǎn)；3.在-244~-214存在DSE(distal sequence element)；4.啟動(dòng)子下游存在5'-TTTT-3'序列為Pol III提供轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)；5.PSE和DSE之間的距離變化可顯著影響轉(zhuǎn)錄效率；6.+1位的G對(duì)轉(zhuǎn)錄效率影響較大。根據(jù)這些特點(diǎn)，在使用U6啟動(dòng)子構(gòu)建RNAi表達(dá)載體時(shí)，U6啟動(dòng)子的長(zhǎng)度最好在300bp左右，盡量不改變PSE和DSE的間距，同時(shí)保留TATA box和+1位的G，在下游應(yīng)有5'-T噑TTT-3'序列作為終止信號(hào)。另外可以根據(jù)需要在啟動(dòng)子上游或終止信號(hào)下游設(shè)計(jì)測(cè)序引物序列、酶切位點(diǎn)等等。 如有興趣可以利用同尾酶設(shè)計(jì)poly-RNAi表達(dá)載體，從而可以觀察同時(shí)knockdown兩個(gè)或多個(gè)基因表達(dá)后產(chǎn)生的效應(yīng)。若是條件允許，可以對(duì)U6啟動(dòng)子進(jìn)行shuffling，篩選具有特殊用途的突變的Pol III啟動(dòng)子。
因?yàn)槿斯ず铣蓅iRNA價(jià)格太高，現(xiàn)在經(jīng)常采用RNAi expression vector，抑制序列一般在19-22bp。使用Pol III啟動(dòng)子時(shí)轉(zhuǎn)錄終止碼為5'-TTTTT-3'，而使用Pol II啟動(dòng)子則為polyA。其實(shí)這兩種終止碼都不能完全避免通讀(readthrough)現(xiàn)象的發(fā)生。現(xiàn)在RNAi多用前者，是因?yàn)槠漭^短，不形成復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)；后者因?yàn)檩^長(zhǎng)，形成的空間結(jié)構(gòu)可能會(huì)對(duì)抑制序列發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成構(gòu)成空間阻礙或產(chǎn)生遮擋效應(yīng)。
可以，這些載體都是真核表達(dá)載體，根據(jù)國(guó)外的經(jīng)驗(yàn)，質(zhì)粒載體的knockdown作用一般僅持續(xù)一周左右，一周后被down的RNA水平即恢復(fù)原有水平，其機(jī)制尚未闡明。推薦使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體達(dá)到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的效果。
上海吉瑪?shù)膕upersilencing shRNA 載體分別使用Pol III依賴H1或者U6的啟動(dòng)子。盡管H1和U6是polⅢ 型啟動(dòng)子，然而可能根據(jù)使用細(xì)胞系的不同，效率有些小的差別。
使用pol III型啟動(dòng)子是為了有效表達(dá)shRNA。這些pol III型啟動(dòng)子包含了表達(dá)RNA上游所有的必要的元件，而且在一個(gè)短的多聚胸苷區(qū)內(nèi)終止。一旦shRNA被表達(dá)，它被轉(zhuǎn)移出細(xì)胞核，在細(xì)胞質(zhì)中被Dicer加工成siRNA。Dicer優(yōu)先識(shí)別由 pol III型啟動(dòng)子產(chǎn)生的shRNA，因?yàn)樗鼈儾粠в?’或者3’兩側(cè)連接的序列。siRNA進(jìn)入RISC復(fù)合體中，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生RNAi效應(yīng)。
在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，RNAi可以通過(guò)直接導(dǎo)入特異阻斷所選擇基因表達(dá)的分子而誘導(dǎo)，導(dǎo)致產(chǎn)生基因功能缺失表型。這些分子可以通過(guò)化學(xué)合成、體外方法制備或者細(xì)胞內(nèi)DNA模板產(chǎn)生。前兩種方法只能用于瞬時(shí)阻斷，可能很難導(dǎo)入難以轉(zhuǎn)染的、不分裂的或者原代細(xì)胞類型。通過(guò)載體導(dǎo)入pol III 啟動(dòng)子表達(dá)的短的發(fā)夾RNA（shRNA）擴(kuò)展了RNAi實(shí)驗(yàn)的選擇，包括穩(wěn)定和可誘導(dǎo)表達(dá)以及病毒導(dǎo)入。
最常見的影響沉默效果的兩個(gè)原因是：轉(zhuǎn)染效率低和siRNA序列設(shè)計(jì)的效果不理想。如果您初次使用siRNA或采用了新的細(xì)胞系，并發(fā)現(xiàn)沉默效果不佳，我們建議您對(duì)轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行檢測(cè)，并選擇優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。如果您已經(jīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行優(yōu)化但是問(wèn)題依然存在，我們建議您換用另一種轉(zhuǎn)染試劑或是采用其他技術(shù)，這也許能提高轉(zhuǎn)染效率。如果已經(jīng)提高了轉(zhuǎn)染效率但是沉默效果仍然未達(dá)到要求，可能是因?yàn)閟iRNA序列設(shè)計(jì)的效果不理想。
迄今為止還沒有明確的siRNA體內(nèi)實(shí)驗(yàn)使用量的計(jì)算方式，在實(shí)驗(yàn)前最好先從文獻(xiàn)中查詢是否已經(jīng)有相關(guān)的文章發(fā)表。對(duì)于常規(guī)實(shí)驗(yàn)，一般使用100 μL的注射體積，濃度為10 to 500 μM。原先用antisense的研究表明，當(dāng)劑量大于20 mg/kg/day (416 mM)時(shí),會(huì)觀察到明顯的毒性。最好針對(duì)您的實(shí)驗(yàn)繪制劑量反應(yīng)曲線。 常規(guī)情況下，給藥劑量可以以 ~5mg/kg/day [~7.7 nmol/day or 100 mM per day]作為優(yōu)化起點(diǎn)。需要注意的是，這個(gè)劑量只是一個(gè)預(yù)實(shí)驗(yàn)的起點(diǎn)，最后的給藥劑量取決于動(dòng)物模型、靶基因、靶組織和給藥方式等因素
上海吉瑪 的siRNA經(jīng)過(guò)嚴(yán)格HPLC純化,已經(jīng)被用戶通過(guò)局部注射用于小鼠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn),并且得到滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
寡核苷酸可以通過(guò)大劑量給藥或使用ALZET微小泵持續(xù)給藥。大劑量給藥時(shí)要慎重，因?yàn)橐延醒芯勘砻鳎阂恍┒拘耘c寡核苷酸反義鏈的濃度有關(guān)，快速給藥時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物下肢癱瘓或致死，所以給藥時(shí)要注意觀察。很多已發(fā)表的論文實(shí)驗(yàn)是通過(guò)尾靜脈給藥的。任何給藥方式都需要優(yōu)化，以確保最佳的導(dǎo)入方式和動(dòng)物的健康。一般拿靜脈注射來(lái)說(shuō)，每天注射一到兩次，連續(xù)注射一到兩周。
體內(nèi)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)包含動(dòng)物模型的選擇、給藥途徑、劑量和給藥次數(shù)等等。siRNA使用的數(shù)量及濃度主要取決于給藥靶點(diǎn)的性質(zhì)，諸如腫瘤的類型，組織的類型，靶基因表達(dá)水平，動(dòng)物模型個(gè)體大小等等，針對(duì)不同的研究模型，最好先查閱相關(guān)資料。
我們推薦RT-PCR的引物應(yīng)該設(shè)計(jì)在target位置的兩側(cè)，而不是同側(cè)。目前已經(jīng)知道的siRNA介導(dǎo)的基因knockdown機(jī)制是RSIC先介導(dǎo)靶mRNA的切割，切割導(dǎo)致靶mRNA的降解，由于切割和降解可能具有不同的時(shí)間點(diǎn)，因此，設(shè)計(jì)于同側(cè)的PCR引物可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果或knockdown效率的低估。 另外，RT-PCR結(jié)果會(huì)因?yàn)榘谢騧RNA降解時(shí)間不同、細(xì)胞內(nèi)靶基因mRNA豐度不同而導(dǎo)致假陰性結(jié)果，特別對(duì)于豐度較高的基因，推薦使用的檢測(cè)方式包括定量PCR、Northern檢測(cè)、western檢測(cè)等。這些方法會(huì)更加真實(shí)的反映RNAi的結(jié)果。
反義核酸和RNAi從作用原理到使用的范圍都有很大差異。這里只能做一個(gè)簡(jiǎn)單的介紹：從原理上說(shuō)，反義核酸是一段與靶基因配對(duì)的單鏈DNA或類似DNA的片段與靶基因結(jié)合，結(jié)果阻止靶基因的轉(zhuǎn)錄或是翻譯，以往的研究表明在反義核酸的研究中，序列的有效性和有效序列的非特異性往往有比較高的正相關(guān)性，這就在一定程度上限制了反義核酸的應(yīng)用。 RNAi的作用機(jī)理是雙鏈的RNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致靶基因的切割和降解。siRNA的序列可以選擇在高度特異針對(duì)靶基因的位置，也就為RNAi作為藥物研究提供了高效、低副作用的空間。自從RNAi技術(shù)問(wèn)世以來(lái)，國(guó)外很多專業(yè)從事反義核酸研究的公司都紛紛轉(zhuǎn)向RNAi研究， ISIS是一個(gè)非常就有代表性的例子。他們認(rèn)為，如果使用反義核酸可以進(jìn)行的研究，以及反義核酸可以涉及的研究領(lǐng)域，RNAi均可以毫不示弱的開展，并且應(yīng)該會(huì)得到更加令人滿意的結(jié)果。 我使用合成的雙鏈DNA克隆載體，但是測(cè)序結(jié)果不正確，是DNA合成的問(wèn)題，還是其他問(wèn)題？ 首先，質(zhì)量良好的、并且是退火狀態(tài)良好的dsDNA是克隆成功的關(guān)鍵因素。一般情況下，需要挑不止一個(gè)克隆測(cè)序（通常是2個(gè)以上），如果兩個(gè)克隆的序列都是錯(cuò)誤的，并且錯(cuò)誤的堿基是相同的,那么基本可以確定是DNA oligo合成的問(wèn)題. 如果兩個(gè)克隆的不同堿基發(fā)生錯(cuò)誤，有可能是合成片段本身的問(wèn)題，也有可能是克隆過(guò)程造成的問(wèn)題，可以再多挑1~2個(gè)克隆測(cè)序確證。大多數(shù)情況下，兩個(gè)陽(yáng)性克隆中，一般至少會(huì)有一個(gè)克隆是正確的，這種個(gè)別堿基在個(gè)別分子中的錯(cuò)誤是合成和克隆過(guò)程共同造成的，但一般發(fā)生的幾率較低。
用RNAi進(jìn)行pathway研究，是RNAi主要應(yīng)用之一。在這樣的課題中，對(duì)照系統(tǒng)的選擇尤其重要。已經(jīng)發(fā)表的和已經(jīng)驗(yàn)證的siRNA為RNA干擾研究提供了系統(tǒng)性對(duì)照。用RNAi進(jìn)行細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的研究，以往已經(jīng)有眾多的文獻(xiàn)報(bào)道，可以查閱上海吉瑪網(wǎng)站www.wdodo.com.cn。
使用什么樣的轉(zhuǎn)染方法，很大程度上取決于您使用的細(xì)胞系： 1.貼壁的、易轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，我們推薦使用RNAi-mate； 2.懸浮的或原代的細(xì)胞，我們推薦使用電擊轉(zhuǎn)化方法； 3.電擊轉(zhuǎn)化效率仍然很低的細(xì)胞，需要選擇載體系統(tǒng)。 上海吉瑪除提供化學(xué)合成的siRNA以外，還提供完整的載體系統(tǒng)，請(qǐng)參閱產(chǎn)品資料。
如果出現(xiàn)細(xì)胞大量死亡，意味著您的轉(zhuǎn)染條件仍然需要優(yōu)化： 轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化一般包括以下幾個(gè)方面： 1. 調(diào)整轉(zhuǎn)染試劑的濃度； 2. 在轉(zhuǎn)染后適當(dāng)?shù)臅r(shí)間內(nèi)更換無(wú)轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)液， 3.調(diào)整細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)；一般處于良好生長(zhǎng)狀態(tài)的細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)染試劑就有更好的耐受性； 4.調(diào)整轉(zhuǎn)染試劑和siRNA的比例； 如果同一管轉(zhuǎn)染試劑在不同實(shí)驗(yàn)中對(duì)細(xì)胞的毒性有差異，一般說(shuō)來(lái)應(yīng)該是實(shí)驗(yàn)過(guò)程本身帶來(lái)的差異； 如果已經(jīng)做了以上幾項(xiàng)工作，轉(zhuǎn)染效率仍然得不到提高，建議您更換一種轉(zhuǎn)染試劑。
好的轉(zhuǎn)染試劑有以下特點(diǎn)：1、對(duì)siRNA有較高的轉(zhuǎn)染率；2、對(duì)細(xì)胞的毒性小。在mRNA水平檢測(cè)siRNA導(dǎo)入的效果比用看家基因的siRNA陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)更為準(zhǔn)確。
熒光素在495nm處有最大吸收率，在520nm處有最大發(fā)射率。
已經(jīng)有為數(shù)不少的實(shí)驗(yàn)室研究過(guò)熒光標(biāo)記的siRNA的熒光檢測(cè)結(jié)果和knockdown效率之間的正相關(guān)關(guān)系。熒光標(biāo)記雙鏈?zhǔn)亲畛Ｓ玫膬?yōu)化轉(zhuǎn)染條件的方法。可以用流式細(xì)胞儀或者熒光共聚焦顯微鏡檢測(cè)標(biāo)記的siRNA。
研究者可以用Beer法則定量RNA：吸光度（260nm）=(摩爾消光系數(shù))*(濃度)*(路徑長(zhǎng)度,cm)。為了便于理解，等式變?yōu)椋簼舛龋剑ㄎ舛?260nm）/[(摩爾消光系數(shù))*(路徑長(zhǎng)度,cm)]。當(dāng)使用一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的10mm比色皿時(shí)，在公式中路徑長(zhǎng)度這個(gè)變量等于1。 6uL濃度為10uM的siRNA溶解液中含有多少ug的siRNA？ 首先計(jì)算含有多少nmol的siRNA： a. 等式: nmol = (6 uL)(10 umol/L)；b. 單位換算: nmol = (6 uL)(10 umol/L)(1 L/1,000,000 uL)(1,000 nmol/umol)；c. 答案: nmol = 0.06 nmol。然后利用siRNA的平均分子量（13,300 g/mol）把nmol變?yōu)閡g：a. 等式: ug = (0.06 nmol)(13,300 g/mol)；b. 單位換算: ug = (0.06nmol)(13,300 g/mol)(1mol/1,000,000,000 nmol)(1,000,000ug/g)；c. 答案: ? ug = 0.798≈0.8 ug。所以6uL濃度為10uM的siRNA溶解液中含有0.8ug的siRNA。 我需要濃度為20uM的樣品，如何計(jì)算重懸siRNA緩沖液的量？ 樣品濃度的計(jì)算如下：（siRNA的量，nmol）/（重懸體積，uL）＝樣品濃度，umol/L。在解答前應(yīng)先統(tǒng)一單位，確保單位可以抵消。例如：您購(gòu)買了20nmol的siRNA，想溶解為50uM的樣品。可按以下方法計(jì)算重懸緩沖液體積：a. 等式: (20 nmol)/ uL = 50 umol/L；b. 解答未知量: uL = (20 nmol)(1 L/50 umol)；c. 單位換算: uL = (20 nmol)(1 L/50 umol)(1 umol/1,000 nmol)(1,000,000 uL/1 L)；d.答案: uL = 400 uL。因此，應(yīng)該使用400uL緩沖液去重懸20nmol的siRNA，溶解后為50uM的樣品。 一定需要陰性對(duì)照嗎？ 是，陰性對(duì)照是RNA干擾實(shí)驗(yàn)中不可缺少的。由于在超過(guò)200 nM的濃度下，siRNA有可能會(huì)導(dǎo)致非特異性的壓力反應(yīng)，在實(shí)驗(yàn)體系中必需設(shè)置陰性對(duì)照。它能夠幫助我們確認(rèn)基因表達(dá)水平的降低是否是序列特異性的RNAi的結(jié)果。由于siRNA的合成方法和工藝以及轉(zhuǎn)染試劑等因素可能導(dǎo)致廣泛的基因沉默現(xiàn)象。如果沒有陰性對(duì)照，研究人員很可能錯(cuò)誤地將廣泛的、非特異性基因沉默當(dāng)作由RNAi引起的基因特異性沉默。 常用的陰性對(duì)照有哪些類型? 常用的陰性對(duì)照大體分為兩種，一種是使用通用陰性對(duì)照序列，該序列已經(jīng)被上千篇文章使用；另一類是使用和靶基因siRNA打亂序列的siRNA作為陰性對(duì)照，這樣的陰性對(duì)照和通用序列相比較，一方面合是按照定制產(chǎn)品價(jià)格合成的，另一方面，由于打亂序列是沒有經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的序列，有可能會(huì)產(chǎn)生off－target現(xiàn)象。因此，除非有非常特殊的要求，最好使用通用序列作為陰性對(duì)照。 在陰性對(duì)照體系中和實(shí)驗(yàn)體系中觀察到同樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這是什么原因？ 這個(gè)結(jié)果充分說(shuō)明了設(shè)置陰性對(duì)照的必要性。該結(jié)果表明您所觀察到的表型不是序列特異性knockdown產(chǎn)生的表型，您需要降低siRNA的工作濃度。 為什么說(shuō)陽(yáng)性對(duì)照在RNA干擾實(shí)驗(yàn)中很重要？ 陽(yáng)性對(duì)照作為一個(gè)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)檢查是很重要的。也就是說(shuō)，當(dāng)您看到siRNA陽(yáng)性對(duì)照的預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，您能確保在您的實(shí)驗(yàn)方法中您的轉(zhuǎn)染、RNA提取物和檢測(cè)方法是可靠的。通常最好的陽(yáng)性對(duì)照是內(nèi)在的對(duì)照 你們能提供預(yù)先合成的siRNA對(duì)照么？ 可以。吉瑪能提供許多預(yù)先合成的用于RNA干擾實(shí)驗(yàn)的對(duì)照雙鏈。 用于對(duì)照的siRNA的最佳濃度是多少？ 陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照的siRNA的濃度都應(yīng)該與基因特異性的siRNA的濃度相同。 不同工作濃度下1OD siRNA可以使用多少次 工作濃度 1 OD siRNA可以使用孔數(shù)（孔） 96孔板 48孔板 24孔板 12孔板 6孔板 100mm dish 5nM 5000 2500
增加siRNA的濃度一般不能改進(jìn)沉默效率。高濃度的siRNA將可能導(dǎo)致去靶作用和對(duì)細(xì)胞的毒性。siRNA的高基因沉默效率來(lái)自于合理的設(shè)計(jì)，在100nM 甚至更低的濃度都可能有75%的沉默效率。另外，低的轉(zhuǎn)染效率會(huì)導(dǎo)致低的沉默效率，建議您更進(jìn)一步優(yōu)化siRNA的導(dǎo)入條件。
我們建議您用于實(shí)驗(yàn)的siRNA的濃度為100nM。1nmol siRNA的量對(duì)于一個(gè)24孔板或是96孔板的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)足夠了。
吉瑪公司為您提供的siRNA是凍干粉包裝的，在常溫下運(yùn)輸。這些凍干的樣品在室溫下能穩(wěn)定保存2－4個(gè)星期，所以放置一個(gè)星期不會(huì)影響其沉默效果。但我們建議您收到樣品后最好保存于-20℃或-70℃有霜冷凍箱中。
懸垂的序列組成是由顧客自行選擇的。最近研究表明懸垂的組成在mRNA靶識(shí)別和酶解中不是很重要。懸垂可能在形成RISC的過(guò)程中起結(jié)構(gòu)的作用。很多研究人員選擇dTdT是因?yàn)檠芯勘砻髅撗鹾颂呛塑漳鼙Ｗo(hù)siRNA免受酶解。合成序列最重要的是確定靶mRNA的19個(gè)堿基的核心結(jié)構(gòu)。
您需要準(zhǔn)確地提供siRNA的19個(gè)核苷酸的靶序列和懸垂的合成物，或者您也可以提供相應(yīng)地基因的GeneID或者Accession Number，由我們公司技術(shù)人員為您免費(fèi)設(shè)計(jì)。
目前RNA寡核苷酸的最大長(zhǎng)度是50堿基。
吉瑪公司的siRNA是雙鏈的,而且也是按照雙鏈來(lái)定價(jià)的。
一般siRNA都具有物種特異性，很少與其他物種有相同的靶位點(diǎn)，所以針對(duì)人體基因設(shè)計(jì)的siRNA不會(huì)沉默其他物種的同源序列。然而，也有研究表明siRNA經(jīng)過(guò)特異性設(shè)計(jì)后能對(duì)兩個(gè)或兩個(gè)以上的物種有效，這需要仔細(xì)進(jìn)行siRNA設(shè)計(jì)和生物信息學(xué)分析。對(duì)兩個(gè)或兩個(gè)以上的物種有效，這需要仔細(xì)進(jìn)行siRNA設(shè)計(jì)和生物信息學(xué)分析。